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解脲脲原体 14 血清型在 BALB/c 小鼠 下生殖道中致病性研究

解脲脲原体 14 血清型在 BALB/c 小鼠 下生殖道中致病性研究. 郑冰洁 韩燕 尹跃平 施美琴 中国医学科学院皮肤病研究所. 英文缩略词. 解脲支原体（ Ureaplasma urealyticum, Uu/UUR ） 微小脲原体（ Ureaplasma parvum, Up/UPA ） 非淋菌性尿道炎（ Non-gonococcal urethritis, NGU ） 男性行为者（ Men who have sex with men, MSM ） 女性性工作者（ Female sex workers, FSWs ）

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解脲脲原体 14 血清型在 BALB/c 小鼠 下生殖道中致病性研究

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Presentation Transcript

  1. 解脲脲原体14血清型在BALB/c小鼠下生殖道中致病性研究解脲脲原体14血清型在BALB/c小鼠下生殖道中致病性研究 郑冰洁 韩燕 尹跃平 施美琴 中国医学科学院皮肤病研究所

  2. 英文缩略词 • 解脲支原体（Ureaplasma urealyticum, Uu/UUR） • 微小脲原体（Ureaplasma parvum, Up/UPA） • 非淋菌性尿道炎（Non-gonococcal urethritis, NGU） • 男性行为者（Men who have sex with men, MSM） • 女性性工作者（Female sex workers, FSWs） • 颜色改变单位（Color Change Unit , CCU） • 不良妊娠结局（Adverse pregnancy outcome, APO） • 支气管肺发育不良（Bronchiopulmonary dysphasia, BPD） • 非淋菌性尿道炎（Non-gonococcal urethritis，NGU）

  3. 研究背景 • 解脲脲原体（Ureaplasmaurealyticum, Uu） • 1954年分离自NGU患者尿道分泌物 • 缺少细胞壁，电镜下菌落50-300nm，可通过0.45μm微孔滤膜 • 具有脲酶，可分解尿素，使培养基中指示剂颜色改变 • 在加锰固体培养基中为棕黑色海胆样菌落

  4. 研究背景

  5. 研究背景 Uu致病性 • 细胞吸附 MgPa蛋白&其他多种蛋白 • 细胞毒性 H2O2 尿素酶分解尿素产氨 pH值改变 • 介导炎性反应 MBA蛋白、IgA蛋白酶、磷脂酶A、C • 细胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、NF-κB • 免疫逃避 MBA抗原变异 Genital Mycoplasmas, Taylor-RobAtlas of Sexually Transmitted Diseases and AIDS, 4, 64-75inson.

  6. 研究背景 盆腔炎（PID） 病理性妊娠，新生儿疾病1, 5, 6 活动性关节炎, 脊柱关节病4 慢性尿道炎症状³ 脓毒性关节炎7 HIV/STI感染风险↑³ 腹膜炎² 宫颈炎 性活跃女性 Clin Microbiol Infect 2011; 17: 1304-1311; J Clin Microbiol 2010; 48(11): 4310-4312; UROLOGY 2009; 74 (1): 62-66 Scand J Rheumatol. 2006; 35(6):459-462; Clin Infect Dis 2004; 39 (8): 1113-1122; J Clin Microbiol 1997;35(5):1199–1202 Br J Rheumatol 1997; 36(6): 661-668

  7. 研究背景 附睾炎 不育 持续性/复发性NGU 泌尿生殖道外疾病（关节炎等） HIV/STI感染风险↑ 前列腺炎 性活跃男性或MSM 直肠炎

  8. 研究背景 • 流行病学资料 • 性成熟无症状妇女：19.8%-60.9% • 无症状妊娠妇女：53.3%-80% • NGU/PID患者：12.3%-56% • HIV/AIDS：16.3%-51.0% • 生物群间： • UPA检出率较高，可能为定植菌群 • UUR与NGU有关，可能是致病菌群 • 无统一结论 • 型别间： • 1型：早产、胎膜早破 • 健康体检人群中3型为主 • 尿道炎患者中检出率最高的是4型 Mol Gen Mikmbiol Vinls01，2001，(1)：28—32；《中国实用妇科与产科杂志》 2003年03期 皮肤性病诊疗学杂志 2011年2月，18（1）

  9. 研究背景 • 动物模型：同一平台、统一宿主条件、避免干扰 • Uu动物模型研究现状 • Furry等经阴道接种Uu首次建立了Uu小鼠阴道感染模型 • 三种小鼠中，BALB/c小鼠对Uu最为敏感 • Uu感染后可上行至小鼠子宫角、卵巢、脾脏等 • 定植后21天至153天可自行消除 • Taylor等阴道接种了5、8、10型至BALB/c小鼠阴道 • 过半数的8型能持续定植超过84日 • 5型、10型定植时间仅21日 J Med Microbiol. 1989;29(2):111-4.； J Med Microbiol. 2002;51(10):866-70. Epub 2002/11/19.

  10. 研究背景 多为一种或几种血清型的动物模型 没有研究针对14种血清型致病性差异 现代生物医学进展 11(03).；Can J Microbiol 57(12): 987-992. 中国实用妇科与产科杂志2005年11月；国际妇产科学杂志2011年12月第36卷第6期

  11. 研究目的 • 建立Uu 14种血清型动物模型，在同一平台上横向评价各血清型间致病性差异

  12. 研究方法 • 标准菌株 • 购自美国美国标准生物品收藏中心（American type culture collection, ATCC） • 实验动物 • BALB/c小鼠、雌性、7周龄、SPF级 • 购自扬州大学比较医学中心[SCKX（苏）2012-0004] • 体重21.93±1.62g

  13. 研究方法 • 饲养环境 • 中国医学科学院皮肤病研究所实验动物中心 • 独立通风笼具（Individual ventilated cages，IVC） • SPF级小鼠维持粮，每日每笼投喂约50g • 灭菌水，每日每笼约200mL

  14. 研究方法 • 培养基配制方法 • 性病中心参比实验室支原体液体及固体培养基SOP • 标准株菌液浓度 • CCU半定量 • 1×107CCU/mL 菌株传代及CCU测定 左图为对照组，右图示CCU为10的Uu菌液

  15. 研究方法 • BALB/c小鼠预处理 • 16组：空白组、雌二醇组及14组感染组，每组15只 • 实验前对每只小鼠阴道冲洗液检测Uu • 适应性喂养1周 • 雌二醇及感染组小鼠大腿外侧肌注苯甲酸雌二醇注射液0.05mL（0.05mg） • 每周注射两次，共4次 • 空白组不做任何处理

  16. 研究方法 • 菌液接种 • 阴道内接种： • 第4次肌注苯甲酸雌二醇当天 • 经阴道接种50ul Uu菌液，第二天重复接种 • 雌激素组接种50μL无菌支原体液体培养基 • 空白组不做处理

  17. 研究方法 • 接种后观察 • 小鼠活动情况、外生殖器外观及外阴分泌物情况 • 大体表现：阴道口脱毛、红肿、渗出糜烂 • 阴道分泌物Uu培养及半定量计数 • 接种第3、7、14、21、35天 • 小鼠阴道冲洗液 • 液体及固体培养基培养 固体培养基培养结果。 2和3示Uu在固体选择培养基中的棕黑色海胆样菌落

  18. 研究方法 • TNF-α检测 • 第3天、第14天、第21天 • 阴道灌洗液标本 • ELISA试剂盒 • 组织病理学检查 • 第3天、第21天各组随机处死5只小鼠 • 解剖取阴道、子宫标本 • 早期：密集的中性多形核白细胞浸润 • 后期：慢性炎症、浆细胞、嗜酸性粒细胞浸润，宫腔腺体扩张、粘连

  19. 研究方法 • 统计分析 • IBM SPSS软件 • 定量资料采用Student t 检验 • 分类资料使用χ2检验 • 检验水准α<0.05

  20. 接种后外阴表现 • 接种后外观表现 • 外阴周围脱毛、糜烂、水肿 • 感染组小鼠阴道分泌物增多 • 白色浆液状分泌物，干涸后形成痂膜封住阴道口（糊口现象） 感染组小鼠阴道外观表现。1为阴道口组织轻度水肿，2、3、4为小鼠尿道阴道周围水肿脱毛，脱毛严重程度递增

  21. 各感染组培养阳性率 • 阳性率随时间下降 • 与UPA相比，UUR阳性率较高、阳性维持时间长 • UUR 10个血清型： • 多数型别至接种后35天仍未转阴 • 2、5型短期即可转阴 • 13型所有时间点均为阴性 • UPA 4个血清型： • Up3型持续时间较久

  22. 各感染组各时间点Uu培养阳性率

  23. TNF-α检测结果 Up1/Uu4：逐渐下降 *数据有统计学意义

  24. TNF-α检测结果 Uu8：先升高后降低 *数据有统计学意义

  25. TNF-α检测结果 Up3/Uu11：先降低后升高 Up14：逐渐升高 *数据有统计学意义

  26. TNF-α检测结果 Uu13：轻度高于对照组

  27. 结果 • 器官大体形态 • 感染组：子宫水肿、充血、阴道充血 • 空白对照组、雌激素组：小鼠子宫、阴道外观无异常 各组小鼠子宫阴道大体形态。1空白组阴道子宫，无水肿，呈现正常肉白色；2 轻度水肿充血的阴道子宫；3 中度水肿、充血的阴道子宫。可见左侧子宫水肿明显，颜色接近透明。

  28. 结果 • 组织病理表现 • 阴道： • 3天：轻度炎细胞浸润、组织水肿 • 21天： 阴道上皮增厚、黏膜层轻度炎细胞浸润 • 子宫 • 3天：子宫内膜及固有层水肿，较多中性粒细胞浸润、腺体扩张、分泌物潴留、宫腔内有较多炎性渗出物 • 21天：嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞浸润；基底层液化；腺体扩张；不同程度的分泌物潴留（Uu8/7/11/12）。Up1/Up3：宫腔粘连及腺体纤维化改变 • 空白对照组及雌激素组：轻度炎性浸润或腺体扩张

  29. 结果 正常的阴道（左）及子宫（右） 子宫腺腔粘连、腺体扩张、分泌物潴留 子宫腺腔大量分泌物潴留

  30. 结论 • 成功建立了Uu 14个血清型的小鼠下生殖道感染模型 • 几乎不累及阴道，主要为子宫的急慢性炎症反应 • Up1/4型：急性炎症反应为主，可被较快清除；1型可造成子宫粘连 • Uu8型：急性炎症反应为主，可演变为慢性持续性炎症反应 • Up3/Up14/Uu11型：感染时间长，慢性持续性炎症反应，3型可造成子宫纤维化 • Uu13型可能为隐性感染 • 其余型别定植时间短、致病性差，为非条件致病菌

  31. 讨论 • 动物模型建立 • 标准菌株及标准操作流程（SOP）、标准喂养环境及独立通风系统 • Uu各血清型致病性情况 • 阴道及尿道口周围脱毛、糜烂、水肿 • UPA组：Up3/14组较Up1/6组多 • UUR组：Uu5/9/11/13组接种后短期即可恢复正常 • UUR定植时间及感染率较UPA组高

  32. 讨论 Uu致病性情况 • 1/3/4/8型致病性已在此前研究中得到证实 • 国内的研究 • 4型外阴改变明显、致病性较强 • 3型可引起慢性炎症反应 • 8型可上行至输卵管 • 1型致病性较弱 • 国外的研究 • 新生儿及孕妇中3型检出率最高 • 多用3型建立宫内感染模型 Moss,2005;Moss,2008; Naessens, 1988; Nelson,1998; Kim,2003;现代生物医学进展 11(03).；Can J Microbiol 57(12): 987-992. 中国实用妇科与产科杂志2005年11月；国际妇产科学杂志2011年12月第36卷第6期

  33. 讨论 • 本研究 • 1/4/8型以急性炎症反应为主 • 1/4型持续时间较短，可较快被宿主清除 • 8型可逐渐演变成慢性炎症反应 • 1型导致子宫粘连 • 3型主要引起慢性持续性炎症反应 • 可导致子宫纤维化 • 或许与不孕、不良妊娠结局等有关

  34. 讨论 • 本研究 • 14型 • TNF-α水平在接种后第21天均达到最高值 • 病理显示为慢性炎症反应 • 提示可能会导致子宫慢性持续性炎症 • 与3型类似 • 目前尚无利用14型建立模型报道 • 致病性尚需进一步证实 • Uu所有型别全基因组分析显示14型与3型在系统进化关系上最近 • 孔繁荣等利用16S rRNA，16S rRNA-23S rRNA基因、尿素酶基因、MBA基因的差异将3型与14型归为一个型别，3/14型。 • 流行病学资料显示14型为共生菌 Kong，2000;Paralanov, 2012，Ren，2003

  35. 讨论 • 6型致病性情况 • 6型感染率较低，可能是定植菌群 • 本研究发现6型致病性较弱 • 宫内动物模型 • 6型可导致严重的胎肺及胎盘持续感染、绒毛膜羊膜炎、子宫内膜炎等 • 妊娠中期6型感染可持续至妊娠终末期 • 患有BPD的早产儿鼻咽及气管分泌物中3型、6型检出率最高 • 提示6型是否主要导致宫内感染？ 黄珺，2014；Francesco，2009；Knox，2013；Sung，2011

  36. 讨论 • 2/9/5/11型 • 本研究中：致病性较弱，可能是条件致病菌或非下生殖道常驻菌群 • 11型多报道为混合感染常见型别 • 早产婴儿呼吸道分泌物中2/9/11型较常见 • 13型 • 本研究中：13型接种后液体及固体培养基中均为阴性 • 炎性因子检测及组织病理像显示产生轻度炎症反应 • 无相关流行病学研究及动物模型报道 • 提示是否是隐性感染？ 流行病学研究结果与动物模型结果不一致？ • 流行病学研究中样本量、检测方法、纳入人群、环境等差异 • 动物不能完全模拟人体环境 • 动物实验中病原体检测方法、小鼠差异等 Sung，2011；Eun，2013

  37. 谢谢！

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