GENETICA 2010

1. GENETICA2010 PARTE II: HERENCIA Teorica 8

2. SISTEMA GENETICO BACTERIANO

3. Ventajas: • La replicacionesrapida • Se produce muchaprogenie • El genomaeshaploide • La reproduccion asexual simplifica el aislamiento de cepaspuras • El cultivo en lab esfacil • Los genomas son chicos • Pueden ser modificadosporIngenieriagenetica

4. Como se estudian? Carbono, Nitrogeno, Fosforo, vitaminas PROTOTROFAS: bacteriassalvajesqueviven en condicionesminimas. AUXOTROFAS: cepasmutantesquecarecen de una o masenzimas o aanecesariasparavivir y requieren de mediossuplementados.

5. Bacterias • Organismos mas abundantes del planeta • Unicelular procarionte • Diversas formas: esferas, barras, helices • Carecen de mb nuclear • Poseen pared celular compuesta por peptidoglicanos. • La mayoria tiene un cromosoma circular, con una molecula de DNA de aproximadamente 4-5x10.000000 pb • Escasa cantidad de DNA no codificante

6. The number of predicted genes Part of the genome that encodes proteins (exons) 5000 90% 6000 70% 18,000 27% 14,000 20% 25,500 20% 80,000 < 5% E.Coli (bacteria) Yeast Worm Fly Weed Human

7. Dentro de lasbacterias hayPLASMIDOS Son circulares Varios miles de pb Propio origen de replicacion (Ori) Se replican de forma independiente en 1 o 2 direcciones.

8. Tipo de plasmido:EPISOMA Puede replicarse libremente o insertarse en cromosoma bacteriano Un ejemplo es el factor F (fertilidad) de E.Coli, que controla el apareamiento e intercambio bacteriano

9. Transferenciagenetica Conjugacion Transduccion (en cel animales: transfección) Transformacion(por lo gral son tecnicas de lab) • La bacteria capta material genetico del medio. Es posible luego un evento de CO, o no. • Un virus transporta material genetico de una bacteria a otra. • El material genetico pasa en forma directa de una bacteria a otra. Se puede producir CO entre lo propio y lo recibido

10. Diferencias con reproduccion sexual: • La reproducion NO ESTA ASOCIADA a intercambio de DNA • Aumenta el tamaño de las células y se dividen por fisión binaria (cada 15-30 minutos)

11. CONJUGACION Demonstration by Lederberg and Tatum of genetic recombination between bacterial cells. Cells of type A or type B cannot grow on an unsupplemented (minimal) medium (MM), because A and B each carry mutations that cause the inability to synthesize constituents needed for cell growth. When A and B are mixed for a few hours and then plated, however, a few colonies appear on the agar plate. These colonies derive from single cells in which an exchange of genetic material has occurred; they are therefore capable of synthesizing all the required constituents of metabolism.

12. Experiment demonstrating that physical contact between bacterial cells is needed for genetic recombination to take place. A suspension of a bacterial strain unable to synthesize certain nutrients is placed in one arm of a U-tube. A strain genetically unable to synthesize different required metabolites is placed in the other arm. Liquid may be transferred between the arms by the application of pressure or suction, but bacterial cells cannot pass through the center filter. After several hours of incubation, the cells are plated, but no colonies grow on the minimal medium.

13. Factor F: • Es un episoma • Tieneori • Tiene genes para la conjugacion (ej, parapili) • Factor F genera muesca en unahebra y se transfieredesdeextremo 5’ • Se replicanambashebras • Se integra al cromosomabacteriano 1/10.000 eventos, (bacteria Hfr). • Si factor F se transfiere con parte del cromosomabacteriano, se llama F’. • Al transferiralgunos genes del cromosomabacteriano, la receptoraes “diploideparcial” o “merocigota” y puedeproducirse CO.

14. Es un episoma • Tiene ori • Tiene genes para la conjugacion (ej, para pili) • Factor F genera muesca en una hebra y se transfiere desde extremo 5’ • Se replican ambas hebras

16. Se integra al cromosomabacteriano 1/10.000 eventos, (bacteria Hfr). • Si factor F se transfiere con parte del cromosomabacteriano, se llama F’. • Al transferiralgunos genes del cromosomabacteriano, la receptoraes “diploideparcial” o “merocigota” y puedeproducirse CO. F’ Diploide parcial o merocigota

17. The transfer of E. coli chromosomal markers mediated by F. (a) Occasionally, the independent F factor combines with the E. coli chromosome. (b) When the integrated F transfers to another E. coli cell during conjugation, it carries along any E. coli DNA that is attached, thus transferring host chromosomal markers to a new cell.

20. Hfr F- toma 100 minutos aprox. • Siempre el paso comienza por F, y los genes se transfieren segun su secuencia en el sentido de orientacion de F, • Se hacen mapeos geneticos mediante conjugacion interrumpida: A > distancia de factor F > tiempo se requiere para ser transferido

21. MAPEO GENICO POR TRANSFERENCIA GENETICA

22. Circularity of the E. coli chromosome. (a) Through the use of different Hfr strains (H, 1, 2, 3, 312) that have the fertility factor inserted into the chromosome at different points and in different directions, interrupted-mating experiments indicate that the chromosome is circular. The mobilization point (origin) is shown for each strain. (b) The linear order of transfer of markers for each Hfr strain; arrowheads indicate the origin and direction of transfer.

23. TRANSFORMACION • Cuando la bacteria capta DNA del medio se dice queescompetente. • La competenciadepende de: • La concentracion de DNA en el medio • El medio • La etapa de crecimiento de la bacteria En labs: Con ClCa Shock termicovuelvemembranamasporosa Shock electrico

24. Regulacion genica:Ecoli, operon lac

26. C T25 T18 C T18 N T25 N Transacetilasa Permeasa β- Galactosidasa Plásmido REAL pREAL FUNCIONAMIENTO DE pREAL MCS T25 CAP AMPc ARNm ENZIMAS T18 ATP ATP AMPc No Produce AMPc Transacetilasa Permeasa β- Galactosidasa Promotor dependiente de AMPc/CAP OPERÓN Lac

27. pREAL AMPc AMPc Plásmido REAL RESUMIENDO “La toxina adenilato ciclasa, se encuentra codificada en dos regiones dentro de pREAL separadas por un MCS”. Gen de interés sano T25 T18 Gen de interés Mutado CTP T25 T18

28. pREAL Plásmido REAL Ensayos de Funcionalidad T25 MCS pREAL Vacío T18 Transformación de bacterias deficientes en Adenilato Ciclasa (cya-) S. REAL 2004

29. Fondo Negro Fondo Claro pREAL Fondo Negro Fondo Claro LB + X-Gal Fondo Negro Fondo Claro LB + X-Gal pREAL + brca1 Wt pREAL + brca1 Mut pREAL + brca1 FS Mac Conkey LB + X-Gal TRANSFORMACIÓN DE BTH pREAL + brca1 FS pREAL + brca1 Mut pREAL + brca1 Wt TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS DEFICIENTES DE Adenilato ciclasa cya- (BTH)

30. pREAL PACIENTE SANO APLICACIÓN DE pREAL A UN CASO CLÍNICO • Utilizamos para este fin el gen hmsh 2 de un paciente con Cáncer de Colon No Poliposo (HNPCC), previamente diagnosticado por procedimientos clínicos y antecedentes familiares de la enfermedad. • Como control utilizamos el gen hmsh 2 de un familiar sano. Obtenemos el ADN a partir de 1,5 ml de sangre periférica.