Wykrycie markerów molekularnych wykazujących związek z odpornością na porastanie pszenżyta;

1. Pszenżyto wyróżnia się wśród zbóż wysoką podatnością na porastanie, co zniechęca producentów do jego uprawy. Ponadto, niezależnie od porastania lub w związku z nim, następuje przedwczesna synteza dużych ilości α-amylazy, powodująca hydrolizę skrobi zapasowej z bielma. Wpływa to, na obniżenie wartości technologicznej ziarna. Aktywność α-amylazy i spoczynek ziarna są uwarunkowane przez odrębne mechanizmy genetyczne. Przy selekcji istnieje zatem konieczność uwzględniania obu cech, które ponadto są silnie modyfikowane przez środowisko. W hodowli poszukuje się nowych źródeł zmienności, a takim rezerwuarem mogą być dzikie formy zbóż, jak wykorzystana w przedstawionych badaniach pszenica T.monococcum. Znaczącą rolę w hodowli odmian odpornych na porastanie i charakteryzujących się niską aktywnością α-amylazy, może przynieść identyfikacja loci genowych, uzyskana dzięki wykorzystaniu markerów molekularnych.

2. Wykrycie markerów molekularnych wykazujących związek z odpornością na porastanie pszenżyta; • Wykrycie markerów molekularnych wykazujących związek z niską aktywnością α-amylazy; CEL PRACY • Ocena możliwości wykorzystania wykrytych markerów w selekcji form pszenżyta odpornego na porastanie.

3. Dwie serie linii introgresywnch Tc/Tm, wytworzone poprzez krzyżowanie pszenżyta z syntetycznym amfiploidem AmAmRR (amfiploid ten został uzyskany w IGR PAN przez doc.W.Sodkiewicza, jako efekt prac nad pokonaniem barier niekrzyżowalności, pomiędzy diploidalną pszenicą Triticum monococcum i żytem Secale cereale cv. Dańkowskie Złote. Do wytworzenia serii A i C w charakterze biorcy genów wykorzystano linię pszenżyta heksaploidalnego LT 176/10, a w serii linii B – linię LT 522/6. Analizą objęto 57 linii introgresywnych: 22 linii serii A i C oraz 35 w serii B. Wykorzystano także pokolenie F2 i F3 (F408) , powstałe w wyniku skrzyżowania dwóch sublinii Tc/Tm z serii A, z formą odmianową Kitaro. Analizowane segreganty charakteryzowały się skrajnie różnymi wartościami porastania (SR) i liczby opadania (FN). MATERIAŁY

4. Techniki : • RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Elektroforeza odbywała się 1,5 % żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. METODY • b. SSR (simple sequence repeats). Elektroforeza produktów odbywała się w zdenaturowanym żelu poliakrylamidowym. Wizualizacja produktów możliwa była dzięki barwieniu żelu azotanem srebra.

5. Przy użyciu metody BSA (bulked segregant analysis) porównane zostały zbiorcze pule DNA z grup skrajnych, roślin z pokolenia F2, pod kątem występowania różnic w składzie wyróżnionych, polimorficznych fragmentów. Zasada metody BSA: Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) pr 897 (SR-) (SR+) Selekcja starterów

6. Seria linii B Przebadano 1000 starterów RAPD. Wyselekcjonowano 19 starterów. Analiza w obrębie form rodzicielskich i pojedynczych linii Tc/Tm Wyselekcjonowano 6 starterów , dających 7 markerów.

7. Tab.1. Startery RAPD, które wstępnie umożliwiły rozróżnienie poszczególnych osobników z grup skrajnych serii B.

8. Próba potwierdzenia związku z porastaniem markerów RAPD wyodrębnionych w serii B, w obrębie linii Tc/Tm serii AC, (pr804/450pz). Pojedynki porastające (SR-) W LT176/10 LT522/6 A C V,VI,IV B Presto Tm Pojedynki nie porastające (SR+) C A C B

9. Próba weryfikacji wyodrębnionych starterów RAPD serii B w obrębie pokolenia F2, będącym rekombinantem pomiędzy linią Tc/Tm i wrażliwym rodzicem oznaczonym symbolem 3R (pr804/450pz). W B7/4/3 B7/4/1 B7/4/2 B7/4/5 (SR+) B7/4/4 B7/4/6 Tm 3R/4 3R/1 3R/6 3R/3 3R/5 Tm * (SR-)

10. Seria linii AC Przebadano 750 starterów RAPD. Wyselekcjonowano 17 starterów. Analiza w obrębie form rodzicielskich i pojedynczych linii Tc/Tm Wyselekcjonowano 6 starterów, dających 7 markerów

11. Tab.2. Startery RAPD, które wstępnie umożliwiały rozróżnienie poszczególnych grup skrajnych w obrębie serii AC.

12. Próba weryfikacji wyodrębnionych starterów RAPD serii AC w obrębie pokolenia F2, będącym rekombinantem pomiędzy linią Tc/Tm i wrażliwym rodzicem (pr1039/700pz). pr1039/700pz Pojedynki nie porastające (SR+) Pojedynki porastające (SR-) A9/2/13 P2/24 A9/2/22 P2/1 Tm pr1148/500pz Pojedynki nie porastające (SR+) Tm A9/2/13 A9/2/22 * P2/24 P2/1

13. Weryfikacja tezy o przeniesieniu genów odporności na porastanie do pszenżyta z T.monococcum • Część polimorficznych prążków występujących u form odpornych, pochodziła od T.monococcum (1 marker w obrębie serii B, oraz 2 markery w serii AC); • W kilku przypadkach, zarówno w obrębie serii B jak i AC, formy wrażliwe na porastanie, wykazywały obecność fragmentu pochodzącego od T.monococcum (2 markery w serii B i 1 marker w serii AC); • U form sklasyfikowanych jako odporne występowały także fragmenty pochodzące od drugiego komponenta rodzicielskiego (3 markery w serii B i 2 w serii AC);

14. T.m16. W Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) LT176/10 LT522/6 Presto Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B, otrzymany techniką RAPD (pr804/450pz).

15. W LT522/6 LT176/10 T.m.16 Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) Presto Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B, otrzymany techniką RAPD (pr231/650pz i 750pz).

16. Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) W LT176/10 Tm16 Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii AC, otrzymany techniką RAPD (pr972/450pz).

17. Pojedynki porastające (SR-) LT176/10 Tm16 Pojedynki nie porastające (SR+) Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii AC, otrzymany techniką RAPD (pr429/900pz).

18. Tab.3 Startery SSR, wykazujące polimorfizm na pojedynkach grup skrajnych w obrębie serii B i AC.

19. 5AS 6AS 7AS gwm635(B-) gwm154(B+) gwm130(B-) gwm60(B-)(AC-) gwm639 (AC+) gwm617(AC-) 4,9cM gwm427(AC-) 5AL 6AL 7AL Na podstawie M.Roder,V.Kozun i inni, Genetics Society of America 1998

20. Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) LT176/10 LT522/6 AC B AC B Tm Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B i AC, otrzymany techniką SSR (gwm60-7AL).

21. Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) Tm LT522/6 B7/4/5 B7/4/1 Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B, otrzymany techniką SSR (gwm154-5AS).

22. Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) LT522/6 Tm B7/4/1 B7/4/5 Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii B, otrzymany techniką SSR (gwm635-7AS).

23. LT176/10 Tm 16 Pojedynki porastające (SR-) Pojedynki nie porastające (SR+) A9/2 Polimorfizm między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych serii linii AC, otrzymany techniką SSR (gwm639-5AS).

24. W związku z tym, iż nie można było jednoznacznie wybrać markera odpornościna porastanie w serii AC, zdecydowano się na badanie nowej populacji F2 (F408), otrzymanej przez krzyżowanie dwóch sublinii z serii A (A9/2/13 i A9/2/22) z wrażliwymi formami odmianowymi Kitaro (P2/1 i P2/24). Analiza BSA objęła 1000 starterów RAPD Wybrano 22 startery, które wstępnie weryfikowano na osobnikach, z których utworzono grupy skrajne; Po analizie obejmującą wszystkie 24 osobniki z grup skrajnych, wykryto 5 markerów RAPD.

25. Tab.4. Startery RAPD, które potwierdziły zdolność do produkcji polimorficznych obrazów, umożliwiających rozróżnienie poszczególnych grup skrajnych roślin, wyselekcjonowanych w pokoleniu F2 (F408).

26. Poszukiwanie markerów wysokiej liczby opadania FN w pokoleniu F2 (F408) Analiza BSA objęła 1000 starterów RAPD Wybrano 25 startery, które wstępnie weryfikowano na osobnikach, z których utworzono grupy skrajne; Po analizie obejmującą 19 osobników z grup skrajnych, wykryto 15 markerów RAPD.

27. Tab.5. Startery RAPD, które potwierdziły zdolność do produkcji polimorficznych obrazów, umożliwiających rozróżnienie poszczególnych grup skrajnych roślin („FN+” i „FN-”), wyselekcjonowanych w pokoleniu F2 (F408).

28. WERYFIKACJA MARKERÓW UZYSKANYCH W POKOLENIU F2 (F408) W POKOLENIU F3 MIESZAŃCA (F408): PORASTANIE (SR) LICZBA OPADANIA (FN) 5 markerów RAPD wyselekcjonowanych w pokoleniu F2 15 markerów RAPD wyselekcjonowanych w pokoleniu F2 WERYFIKACJA 3 markery RAPD pomyślnie zweryfikowane w pokoleniu F3 8 markerów RAPD pomyślnie zweryfikowanych w pokoleniu F3

29. Tab.6. Weryfikacja markerów RAPD odporności na porastanie. Segregacja w obrębie osobników nie porastających (SR+) i porastających (SR-), pokolenia F2 i F3.

30. Tab.7. Weryfikacja markerów RAPD wysokiej liczby opadania. Segregacja w obrębie osobników z wysoką (FN+) i niską liczbą opadania (FN-), pokolenia F2 i F3.

31. Pojedynki nie porastające (SR+) Pojedynki porastające (SR-) W A9/2/13 Tm16 P2/24 A9/2/22 P2/1 Różnice między pojedynczymi osobnikami z grup skrajnych w obrębie pokolenia F2 (F408), otrzymany techniką RAPD (pr651/640 i 650pz).

32. Pojedynki nie porastające (SR+) A9/2/22 P2/24 A9/2/13 P2/1 Tm 16 Pojedynki porastające (SR-) Różnice między grupami skrajnymi (SR+) i (SR-), pokolenia F3, ujawnione przy użyciu startera 651/640pz i 650pz.

33. Pojedynki z wysoką liczbą opadania (FN+) Pojedynki z niską liczbą opadania (FN-) P2/24 Tm16 P2/1 A9/2/13 A9/2/22 Różnice między grupami skrajnymi (FN+) i (FN-), pokolenia F2, ujawnione przy użyciu startera 972/500pz.

34. P2/24 Pojedynki z wysoką liczbą opadania (FN+) Tm16 A9/2/22 P2/1 A9/2/13 Pojedynki z niską liczbą opadania (FN-) Różnice między grupami skrajnymi (FN+) i (FN-), pokolenia F3, ujawnione przy użyciu startera 972/500pz.

35. Efekty poszukiwań markerów porastania w pierwotnych liniach introgresywnych Tc/Tm, nie pozwalają na sformowanie jednoznacznych wniosków. Wykryte markery nie potwierdziły swojego związku z porastaniem w rekombinantach F2. Przyczyny zaistniałej sytuacji mogą być następujące: • Cecha odporności na porastanie u pszenżyta ma podłoże wielogenowe (dlatego trudno jest otrzymać jeden decydujący marker, różnicujący formy wrażliwe od odpornych i odwrotnie); PODSUMOWANIE • Nie wszystkie fragmenty pochodzące od T. monococcum, obecne u linii introgresywnych Tc/Tm, niosą geny odporności na porastanie; • Stopniowa eliminacja fragmentów lub całych odcinków introgresywnych w kolejnych pokoleniach krzyżowań.

36. W pokoleniu F2 , będącym potomstwem linii introgresywnej Tc/Tm serii A i wrażliwą formą uprawną, zidentyfikowano 5 markerów związanych z odpornością na porastanie (SR) i 15 związanych z wysoką liczbą opadania (FN). PODSUMOWANIE • Wyselekcjonowane markery, pomyślnie zweryfikowane w obrębie pokolenia F3 (F408), 3 mające związek z odpornością na porastanie i 8 z wysoką liczba opadania, mogłyby by zostać wykorzystane do selekcji roślin odpornych od wrażliwych i o niskiej aktywności α-amylazy w obrębie dalszych pokoleń analizowanego mieszańca.