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猪肝组织中 核酸的提取及其成分鉴定

猪肝组织中 核酸的提取及其成分鉴定. 生物化学实验 CQMU. 添教材 生物化学与分子生物学实验室 2008.09. 【 实验目的 】. 1 、学习离心技术，掌握 离心机的正确使用。. 2 、了解本实验设计思路。. 生物大分子的分离提取原则. 生物大分子分离提取原则是以生物大分子的理化性质（分子大小、形状、溶解度、带电性质等）为依据，周密设计分离提取流程图，将目的分子与其他分子分离提纯的过程。. 生物大分子的分离提取原则. 生物大分子的分离提取工作是一件十分细致的工作，可谓系统工程，既要设法得到目的分子的纯品 , 又要努力保持其生物学活性，还要得率高。.

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猪肝组织中 核酸的提取及其成分鉴定

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Presentation Transcript

  1. 猪肝组织中核酸的提取及其成分鉴定 生物化学实验 CQMU 添教材 生物化学与分子生物学实验室 2008.09

  2. 【实验目的】 1、学习离心技术，掌握 离心机的正确使用。 2、了解本实验设计思路。

  3. 生物大分子的分离提取原则 生物大分子分离提取原则是以生物大分子的理化性质（分子大小、形状、溶解度、带电性质等）为依据，周密设计分离提取流程图，将目的分子与其他分子分离提纯的过程。

  4. 生物大分子的分离提取原则 生物大分子的分离提取工作是一件十分细致的工作，可谓系统工程，既要设法得到目的分子的纯品,又要努力保持其生物学活性，还要得率高。

  5. 生物大分子的基本制备技术 生物大分子的制备过程包括： 选材、 细胞破碎和细胞器分离、 生物大分子的分离提取、 样品纯化、 样品浓缩干燥和储存等方面。

  6. 分离纯化的基本步骤 1、取材 2、组织细胞破碎 3、提取 4、分离纯化 5、结晶 6、分析鉴定

  7. 分离纯化蛋白质的总原则 • 、选择目的蛋白含量较高的材料； • 、弄清欲纯化的蛋白质在各种试剂和拟采用 • 的条件下稳定性如何； • 、探索和应用有效的抽提和粗提纯方法； • 、建立一套层析方法进行细提纯； • 、用较好的方法保存提取物； • 、提取蛋白质的纯度鉴定。

  8. 离心技术 离心机根据应用目的分为制备和分析两种用途。 制备用离心机是应用最广泛的离心机，根据其性能可分为低速离心机、高速离心机和超速离心机。

  9. 离心机和离心法 一种通过使样品绕离心转轴的中心旋转而在其上产生一个远大于地球重力的仪器。 不同大小、不同形状、不同密度的颗粒在同一离心力场内会以不同的速度沉降而分离。 颗粒的沉降速度取决于离心机的转速和颗粒与中心轴的距离。

  10. 离心力的计算 离心机的加速度通常用重力加速度(g=9.80m.s-2 )的倍数表示,被称为相对离心力(RCF或g值)。 RCF取决于转子的转数(n,以每分钟转数计,r/min)和旋转半径(r，以mm计): n 2 RCF = 1.118 r 1000 RCF在离心管内不相同，靠转子外最大,靠中心轴最小，有表可查。

  11. 离心机种类及用途 1、低速离心机 常规使用,台式,最大速度3 000~6 000r/min, RCF可达6 000g。常用于收集细胞、细胞核或叶绿体等较大的细胞器、抗原-抗体复合物等粗颗粒沉淀。 2、高速离心机 较大立式，常有制冷系统。最高速率可达25 000r/min、RCF达60 000g。用于分离微生物细胞、线粒体、溶酶体等细胞器和蛋白质沉淀物。

  12. 3、超速离心机 一类速度非常高的离心机，最大转速可超过30 000r/min，最大RCF可达600 000g，用于沉淀核糖体、膜泡等小的细胞器和生物大分子。具有精密的制冷、真空装置。 4、微量离心机 台式,能迅速加速到12 000r/min,10 000g 用于短时间(0.5 ~1.5min)对大颗粒沉淀、小 体积溶液(小于1.5ml)的沉降，尤其用于从液 体培养基中快速分离细胞。

  13. 亚细胞结构的分离 生物颗粒在离心场中所需离心加速度和时间 离心加速度 时间 沉降的组分 100g 5min 真核细胞 4 000g 10min 叶绿体 细胞碎片 细胞核 15 000g 20min 细菌、线粒体 30 000g 30min 溶酶体、细菌细胞碎片 100 000g 3~10h 核糖体

  14. 实验步骤 分离提取核酸 猪肝匀浆制备 水解核酸 鉴定 离心

  15. 【实验原理和操作】 1.制备肝匀浆 猪肝 +生理盐水 肝匀浆 匀浆器

  16. 【实验原理和操作】 2.分离提取核酸 肝匀浆倒入刻度离心管(4ml) 加2%三氯醋酸4ml,搅匀 静置3min，3000转离心5min 倾去上清液，沉淀中加95%乙醇4ml，搅匀 沸水中加热至沸2min 取出冷却后离心（3000转/分，5min）

  17. 取出冷却后离心 倾去上清液，离心管倒置于滤纸上倒干乙醇 加10%NaCl溶液4ml，搅匀 离心管置沸水中加热8min(用玻棒不断搅拌) 取出冷却后离心 将上清液倒入小烧杯内 取等量95%乙醇逐滴加入 静置10min，转入离心管离心 倾去上清液，即得白色核酸钠盐沉淀

  18. 3.水解核酸 含有核酸钠盐的离心管 加入5%H2SO4溶液4ml 用玻棒搅匀，在沸水中加热15min 核酸硫酸水解液

  19. 【鉴定的原理】 浓酸 绿色复合物 糖醛 +3,5二羟甲苯 核糖 3H2O 还原 磷钼酸 磷酸+ 钼酸铵 钼兰(兰色) 氨基萘酚磺酸 兰色化合物 浓酸 脱氧核糖 ω-羟γ-酮戊醛 +二苯胺 3H2O 硝酸银 嘌呤碱 灰褐色沉淀

  20. 磷酸鉴定 还原 磷酸+ 钼酸铵 磷钼酸 钼兰(兰色) 氨基萘酚磺酸

  21. 嘌呤碱鉴定 硝酸银 嘌呤碱 灰褐色沉淀

  22. 核糖鉴定 沸水加热5min,比较两管颜色. 浓酸 绿色复合物 糖醛 +3,5二羟甲苯 核糖 3H2O

  23. 脱氧核糖鉴定 沸水加热5min,比较两管颜色. 兰色化合物 浓酸 脱氧核糖 ω-羟γ-酮戊醛 +二苯胺 3H2O

  24. 离心机使用注意事项： 1.记住离心管编号； 2.离心管必须先平衡后才对称放入离心机； 3.避免液体洒在离心机或钻头； 4.启动后，如有不正常噪音或震动，立即切断电源，分析原因，排除故障。

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