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转氢酶(GOT、GPT)的提取和测定 (分光光度法 )

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转氢酶(GOT、GPT)的提取和测定 (分光光度法 ) - PowerPoint PPT Presentation


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转氢酶(GOT、GPT)的提取和测定 (分光光度法 ). 实验目的. 熟悉转氨酶的测定方法。. 实验原理. 氨基酸分子上的 氨基 转移到 α — 酮酸 分子上的反 应,称为转氨反应,由转氨酶催化。谷氨酸 — 草 酰乙酸转氨酶 (GOT) 和谷氨酸 — 丙酮酸转氨酶 (GPT) 是两种最普遍的转氨酶。. GOT 能催化如下反应: 此反应可与苹果酸脱氢酶相偶联,从而用来测定该酶的活性。 测定 NADH 在 340nm 或 366nm 处的吸光度的变化, 即可计算 GOT 的活性。. GPT 能催化如下反应:

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Presentation Transcript
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实验目的
  • 熟悉转氨酶的测定方法。
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实验原理
  • 氨基酸分子上的氨基转移到α—酮酸分子上的反
  • 应,称为转氨反应,由转氨酶催化。谷氨酸—草
  • 酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸—丙酮酸转氨酶
  • (GPT)是两种最普遍的转氨酶。
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GOT能催化如下反应:

此反应可与苹果酸脱氢酶相偶联,从而用来测定该酶的活性。

测定NADH在340nm或366nm处的吸光度的变化, 即可计算GOT的活性。

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GPT能催化如下反应:

反应与乳酸脱氢酶相偶联, 生成的丙酮酸转化为乳酸,NADH变成NAD+

测定340nm处NADH的OD值, 即可计算GPT的活性。

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器材与试剂
  • 1.实验仪器 搅拌器,紫外分光光度计,冷冻离心机,试管,烧杯
  • 2.实验试剂 苹果酸脱氢酶,乳酸脱氢酶,
  • 3mg/ml NADH,0.005mol/Lα-酮戊二酸,
  • 0.2mol/L D,L—天门冬氨酸盐,
  • 0.2mol/L D,L—丙氨酸
  • (以上试剂均用0.05mol/L Tris—HCl(pH 7.2)缓冲液配制
  • 3.实验材料 日本珊瑚树嫩叶
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实验步骤
  • 1.酶粗提液的制备
  • 称取植物材料日本珊瑚树嫩叶 1g,按质量g:体积=1:9
  • 的比例,加入9倍体积PH7.2的0.05mol/LTris—HCl缓冲
  • 液,用搅拌器进行搅拌
  • 使之混匀,得到的匀浆在0℃下用20 000g离心20min,上
  • 清液即为酶的租提液。
  • 2.酶活性的测定(分光光度法)
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操作过程:

(1)GOT活性的测定 按表下表所示加入溶液体积数,配成COT反应液。

混匀,室温放置5 分钟,505nm 波长,双蒸水调零,测各管 OD 值。

以(绝对OD 值=测定管OD 值-对照管OD 值),查标准曲线,求得相应的AST∕GOT活力单位。

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(2)GPT活性的测定 按下表所示加入溶液体积数,配成GPT反应液。

混匀,室温放置5 分钟,505nm 波长,双蒸水调零,测各管 OD 值。

以(绝对OD 值=测定管OD 值-对照管OD 值),查标准

曲线,求得相应的ALT∕GPT活力单位。

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先计算得到每µmol NADH的0D值,则可计算酶的活性大
  • 小。为此先读取未加酶时反应的0D值,除以反应液中
  • NADH的量(3mg/ml=4.5mmol),即0D/4500 µmol,就
  • 可以得到1µmolNADH被氧化时0D的变化值。
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计算公式:

本实验计算只需根据AST∕GOT和ALT∕GPT标准曲线计算公式求得对应的卡门氏单位即可。

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注意事项

1、比色法中常用的有赖氏(Reitman-Frankel)法及金氏(King)法。赖氏法标准曲线所定单位数,是用实验方法和卡门氏分光光度法(速率法)作对比测定求得的。以卡门氏单位报告结果,比较准确。

卡门氏单位定义:1ml 液体,反应液总容量 3ml,340nm 波长,1cm 光径,25℃,1min 内所生成的丙酮酸,使NADH氧化成NAD+而引起吸光度每下降 0.001 为一个卡门氏单 位。 (1 卡门氏单位=0.482IU/L,25°C)

2、当标本酶活力超过 150 卡门氏单位时,应用生理盐水将标本稀释后进行测定。

3、加入 2,4-二硝基苯肼溶液后,应充分混匀,使反应完全,加氢氧化钠溶液方法要一致,不同方法会导致吸光度读数的差异。

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The end

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