各種疾病的分子基礎

各種疾病的分子基礎 • 多基因突變的檢測方法 • 反向斑點雜交( Reverse dot hybridization) • 對突變的基因型設計該突變基因型特異的寡核苷酸( allele specific oligonucleotide, ASO)探針來進行檢測 • ASO一般使用約20 bp長的寡核苷酸，利用一條與正常序列相同及一條與突變者相同的寡核苷酸 • 用放射線或螢光物質標示寡核苷酸，分別與PCR產物做雜交反應，只有完全相同序列的寡核苷酸才能與待測PCR產物雜交，才會會顯示訊號 • 只要有一個鹼基錯配，就不會雜交 • dot blotting是直接將樣本固定在NC paper上，然後進行ASO雜交，不像Southern blotting必須先跑電泳分開 • 依據不一樣的寡核苷酸的探針位置，就可以偵測不相同基因或不相同位點的突變

毛細管電泳( capillary electrophoresis， CE ) • 現在自動定序儀的基本原理 • RT-PCR • PCR以DNA為模板，不能以RNA為模板 • 因RNA 太不穩定 • 到處充滿RNase，會將RNA水解 • 先將RNA反轉錄成DNA • mRNA都帶有poly A tail，利用此特性把 mRNA分離出來 • 分離出來的mRNA，在reverse transeriptase (RT)的作用下形成第一股cDNA

一般使用的RT有二個來源 • 禽骨髓細胞瘤病毒Avian myeloblastoma virus (AMV) • 鼠白血病病毒Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV) • 純化的AMV-RT由二條鍵組成，具有primer-dependent聚合酶活性，最適溫度5‘→3’是42°C • 較強RNase H的活性使cDNA的產量下降也限制了長度 • 可將RNA-DNA雜合體 (RNA-DNA heteroduplex product)的RNA水解

Mo-MLV為單鍵，具有RNA聚合酶活性，最適溫度為37°CMo-MLV為單鍵，具有RNA聚合酶活性，最適溫度為37°C • 較弱RNase H活性，可以得到較長的cDNA • 但是作用溫度較低，無法消除mRNA的二級結構，不利RT-PCR的進行 • RT是一種primer-dependent聚合酶 • 需mRNA當模板 • primer來做5’→3’的引子延伸 • 引子有：gene-specific primer、oligo (dT) primer、random hexamer primer

gene-specific primer： • 將目標RNA或相同保留序列的mRNA家族合成第一股cDNA • oligo (dT)primer • 與mRNA 3端的poly (A)結合，須通過3’UTR(untranslation region)才能到達coding區域，mRNA愈長，要得到全長的cDNA就越困難 • 6聚寡核苷酸隨機引子 • cDNA第一股合成會從不同的mRNA 位置開始 • 可得到大、小不等的cDNA，coding區域及5‘端序列也可 • 適合長mRNA或有複雜二級結構的mRNA

RNA display， Differential display-PCR (DD-PCR) • 1992 Liang、Pardee和Welsh 使用PCR的方法，將mRNA以cDNA的方式呈現出來的方法稱RNA display (Differential display-PCR) • 可快速且同時將不同的細胞的mRNAs呈現出來比較 • 不同的細胞，有不同的mRNA表現，即所謂的組織特異性( Tissue Specific) • 比較不同細胞的表現基因，就可以知道哪些基因被表現或被關掉

Differential display的主要步驟 • 設計一個含有大約12個T及鄰接T的二個任意鹼基(T除外)的antisense primer，在RT的作用下，合成第一股cDNA • 設計一條約10鹼基的random primer做PCR的擴增 • PCR產物跑denaturing polyacrylamide gel及自動顯影，比較跑出來的patterns • 將差異的地方再以PCR擴增下來做cloning及sequencing

第一股cDNA 的合成是使用12個dT，鄰接T的最後二個鹼基NM做排列組合有 • AA,AG,AC,GA,GG,GC,CA,CG,CC,TA,TG,TC共有12種組合 • 使用修飾過的3‘-oligo-dT primer將一小部分的mRNA 擴增下來比較分析 • 使用12種組合中的一種，理論上來講只有全部 mRNA的1/12會被擴增下來

5'-random primer • 此技術的限制是PCR產物的分離，因定序膠大於500 bp時就不能分辨 • 注意事項 • :長度設計在10 bp， AT和GC的含量相同，no dimer or stem-loop • random primer的5‘端前二個bp設計成GC或CG可以產生最高數目的 PCR產物，在3’端設計成G也可 • 較長的5 ‘-random primer (25-28 mers)，增加DD-PCR的再現性( reproducibility)，也降低了膠上的band數目 • 愈長的引子Annealing的溫度就要愈高，增加了引子的特異性 • dNTP的濃度降到2 mM時會增加DD-PCR的特異性，一般標準的PCR dNTP濃度是 200 mM • 低dNTP濃度下，有利於具放射性的 dATP插入引子的複製延伸中 • 以1 kb需要60 sec而言， DD-PCR (extension)限制在30 sec

DD-PCR好處 • 不同的基因表現型式可以很快在同一片膠上比較出來 • 可以將不同的或差異的條帶切下來，做進一步的選殖和定序 • 實驗的結果重複做再現性高 • 較其它傳統方法更快速又簡單 • 基因晶片DNA chip 、Gene chip 、DNA microarray • 基因體解碼的後基因時代，龐大資料，單靠簡單的分生技術實難分析 • 生物資訊學的發展 • 基因晶片的大量分析技術

高密度的寡核苷酸微陣列( oligo chip) • 將特定已知約20 bp的寡核苷酸點在基板上 • 每一點都是不一樣的DNA序列 • 將一個基因的可能突變序列都點在一片晶片上 • 待測的DNA做標記，與晶片的probe雜交 • 以雷射共聚焦顯微掃描器，對雜交信號進行判讀，可以作為診斷及(定序?) • DNA chip • 將一個基因的片段(約120 bp)點一點 • 一個小小晶片上可點數萬點 • 可將人類大約2萬多個基因全部點在一片晶片 • 可研究基因表現的差異 • 把不同來源的mRNA，反轉錄成cDNA並且使用不同顏色的螢光來標記 • 與晶片雜交，可比較差異或量上的變化

基因晶片的基本原理及應用 • 基本原理 • 反向斑點雜交( reverse dot blot analysis) • 探針分子固定在基板上，探針的為cDNA或 genomic DNA的PCR 產物或是合成的寡核苷酸 • 美國Affymetrix公司使用光照原位合成( in situ synthesis) • 比較基因組雜交( comparative genome hybridization， CGH ) • 1992年Kallioniemi 等人所發展出來 • 使用二種不同的螢光顏色分別標記待測DNA及正常對照組DNA樣本，二者混合後與正常中期的染色體雜交，最後根據兩種探針在雜交區域螢光顏色的強度比，進行基因(缺失、重複、擴增)量的分析

利用的fiber optic bundles及beads，或合併flow cytometey等方法 • 基因分型( genotyping ) • 定序已知重要的基因，如抑癌基因P53、BRCAI或遺傳疾病cystic fibrosis等，以發現突變所在 • 偵測臨床上有重要功能的基因型，如將所有藥物代謝有關的基因及其變異型組合成一晶片來預測病人服藥後的代謝情形，或避免藥物的不良反應，或決定藥物的劑量等 • 偵測基因體內所有鹼基的點變異single nucleotide polymorphism (SNP) ，此種晶片可用於疾病基因的關聯性分析，親子鑑定，人種的遷移等，可取代過去利用microsatellite （STR）的分析方法。

基因表現( gene expression)相關的研究 • 偵測生物體（所有）mRNA的表現情形 • 身體地圖( body maps) ，利用整個基因體mRNA的表現晶片分析全身各種組織的所有mRNA表現，了解組織特異性及非特異性基因，了解它們的調控情形及受外來因素的影響的異同 • 藥物影響組織的基因表現差異性; 罹病狀態與正常的差異，如癌細胞與正常細胞的差異，糖尿病與非糖尿病的基因表現差異等 • 剖析各種代謝或訊息傳導等相關途徑，如經由某些代謝或訊息傳導等相關基因突變或表現量的改變，利用mRNA表現晶片來探討它們對於相關途徑的有關基因影響及整個表現基因體的影響 • 探討生物體受環境變化的影響，如藥物的作用，溫度的變化‘pH的變化等 • 探討生物體發育生長的變化，如由單一受精卵細胞分裂成二個、四個...等細胞時，基因表現的差異

探討另類剪接或發現exon • 可利用含有所有基因的exon晶片，來探討各個組織每個基因的exon利用情形，因而可了解是否有另類剪接( alternative splicing) • 每30個鹼基或更多，就設計一個60 bp的probe，涵蓋整個基因體或某一條染色體，在與不同組織的RNA反應，依據其反應的結果就可推測exon及intron 所在，及是否有組織特異的另類剪接 • 探討non-coding RNA • 基因體中，有一些序列轉錄後並不會被轉譯成蛋白質，此轉錄後的RNA稱non-coding RNA ，可能具有調控其它基因表現的功能，如micro RNA可抑制其target genes的表現，因此利用 micro RNA的晶片可探討micro RNA在生物體發育，生長疾病狀態...等扮演的角色。

探討病原體及其特性 • 偵測未知檢體是否有病原體存在，因此晶片上可放入各種不同的病原體DNA系列經由反應後，即可了解病原體為何 • 偵測病原體的特性，如抗藥性，對宿主的影響相關因子等 • 探討起動子(promoter)甲基化 • 基因起動子的甲基化會造成該基因的不活化，因此經由整個基因體起動子甲基化晶片的研究，即可了解基因活化的狀態及其意義 • 探討染色體上基因或DNA片斷的增多或減少 • 過去可利用CGH的方法來偵測染色體上DNA片斷的增多或減少 • 目前已有晶片含有人類所有的DNA片斷，經由反應後，即可了解在染色體上那部分有增多或減少 • 也有晶片含有固定copy數人類所有基因，經由反應後即可了解基因 copy數的變化。

檢測DNA量變化的方法 • 絕對定量( absolute quantitation)方面，主要是應用於病毒及病原菌的偵測，必須有已知濃度的標準樣品，利用這種已知濃度的樣品與受檢的樣品比較就可以得知 • 相對定量( relative quantitation )方面，藉由一個在組織表現量穩定的基因(例如: 1的rRNA， GAPDH， B-actin....等)來比較待測基因量相對的變化，這個方法廣泛應用於基因量表現的研究

PCR方法在量分析存在的一些問題 • PCR的動力學 • PCR產物一開始並不是呈指數增加，在後面的回數甚至沒有量的變化，只有在指數增加期才能在量方面有變化上的意義 • PCR的整個動力學可以分成三個階段 • 早期階段(E) 在初期回數裹，因為PCR產物量太少，無法精確地偵測到每個cycle所產生訊息強度的變化 • 指數增加期(M) 當cycle數到某一數目以後，所產生的每一cycle的變化，就可精確偵測出訊息強度的變化，這個時期的PCR產物是呈指數累積 • 高原期(L) 一隨著反應回數的增加，必定會消耗反應的成分或增加了抑制PCR反應的作用，所以在這個時期並沒有量的增加

影響PCR定量的原因 • PCR高原期沒有量的變化，原因是因為產物濃度逐漸上升，有限的受質及Taq被漸漸消耗掉，造成反應產物不再增加 • 不同來源的檢體，每一次PCR所呈現的動態反應不一致 • 抑制劑污染，會影響PCR的反應效率 • 不同的PCR機器有效率上的差異

以PCR為基礎發展出評估量變化的方法 • Quantitative competitive PCR • 要克服每一次動態反應不一致的問題可以使用Competitor PCR • PCR反應液裡再加入定量的參考RNA或DNA，而且與目標序列是使用同一組primer • 使用同一組primer理論上來講， PCR的效率、目標序列與參考序列應該是一樣 • 做一系列的濃度稀釋，加入待測的目標樣本，然後各跑PCR，每一管的濃度差異越小更能正確反應目標DNA的濃度變化 • 因參考的序列濃度已知，只要找在電泳照片上亮度一樣的條帶就表示濃度一樣。 • 因參考的量已知，目標序列的量變化就可以比較出來 • 事實上Competitor與目標DNA的效率也不是一樣，二者是競爭關係，導致結果的量與原模板的量被高估或低估，並不能真正反應正確量的變化

基因的表現在mRNA層次上，才有量的變化 • 有些疾病或腫瘤有基因的缺失或基因被擴增，如單套體或三套體，基因的DNA複本數有改變時就是所謂的gene dosage分析 • 也可使用quantitative competitor PCR的方法來擴增DNA上基因複本數的變化 • semi-quantitative RT-PCR半定量方法 • 藉由偵測指數期量的變化，可得知樣本mRNA量的變化或提供一個相對的變化 • 在PCR的指數增加期，分別將樣本所產生的PCR 產物取出跑電泳分析，就可分辨 • 須要一個不會有量變化的基因，當控制組 • 基因表現差異很大時才容易分辨出來，最重要是必須重複做，保證實驗結果的一致性及再現性

Real-time quantitative PCR • PCR的基礎上加上螢光檢測技術 • 螢光定量的基礎：螢光強度在一定範圍內是與螢光物的濃度成正比 • DNA binding dye • ethidium bromide可由UV偵測 • SYBR Green I及 SYBR Gold • 只要有雙股DNA合成就可定量，不必合成primer，壞處是非特異性的雙股產物也會被黏上，也會有螢光反應，結果就不正確

解鏈曲線分析 ( melting-curve analysis) • 達到雙股DNA的Tm值時，因為雙股鏈分開，會降低DNA binding dye的信號強度，可以利用這種方法來偵測單一鹼基的突變 • Single-nucleotide polymorphisms (SNPs) • 設計二個 Allele-specific引子，分別只跟特定的Allele黏上 • Anti-sense primer設計成兩個Allele都適合的引子 • PCR時會有Homozygous及Heterozygous的產物產生 • 更區別Tm值的不同，將其中一個引子，在5'端多加一個GC尾巴，做PCR時能同步偵測Tm值的不同，而分析出不同的基因型

螢光淬滅及螢光共振能量轉移 • 螢光淬滅是指會引起螢光物質螢光強度消滅的過程，引起整個過程的物質就是淬滅劑( Quencher ) ，一般使用的螢光物質與淬滅劑在50Ẵ內會抑制螢光的產生，這個結構被破壞時螢光物就不會受抑制而有螢光產生 • 螢光共振能量轉移，就是利用二個靠近的螢光物質，會發生能量轉移，經由轉移能量的大小來做為定量的依據

TaqMan系統 • 利用Tag DNA polymerase的5‘3’外切酶的活性 • 先合成一個probe 5端帶一個螢光染料作為報告者( Reporter) ，3端帶一抑制者的螢光染料(Quencher) • Reporter跟 Quencher二個靠在一起就不會有螢光放射出來，也就是沒有信號可以偵測 • probe是設計在要偵測的DNA序列中，做PCR時，與序列雜交的probe會被5‘ →3’外切酶切掉 • Reporter 沒有Quencher的抑制下，PCR產物增加，信號也增強，就可做量的分析 • 也可使用多種螢光染料，同時偵測不同的PCR產物( Multiplex PCR) • 很類似PCR-ASO，加入一特異性的probe更增加特異性，同時有定性及定量 • 靠近5端引子小於150 bp，效率及再現性都會較好

FRET系統Foster resonance energy transfer through space • 利用Annealing的階段，使用二個鄰近的probe各帶有一個螢光成分， • 一個探針的3‘端是能量提供者(donor) ，另一探針的5’端是能量接受者(acceptor) • 當螢光成分靠在一起時，發生能量轉移，會有螢光信號產生出來 • PCR產物越多的時候，二個probe在Annealing階段黏上單股DNA的情形就越多，能量轉移就愈好，當然所放射出來的強度就越強 • 缺點 • 要設計二個相鄰probe，範圍大約1-5 bp • 使用這種方法來做SNP分型 • probe與它的互補序列完全互補上時它的Tm值會高於mismath • 將SNP 的位置設計在一個probe的中間，藉由偵測Tm改變（相差5-8°C左右），就可加以分型

分子信標molecular beacons • 為一個髮夾式的結構，環狀的部分與目標序列互補 • 臂的部分形成自身鏈內的互補 • 夾子的5‘端含有一個Reporter螢光團和3’端 Quencher螢光團 • 當形成髮夾結構時沒有螢光產生，也就是二個靠在一起就沒有可偵測的螢光產生 • 當環狀部分與目標序列雜交後，髮夾結構就會展開，這時Reporter因為沒有Quencher的抑制作用所以會發出螢光 • 缺點：除了考慮probe與模板的Tm 值外，還須考慮自身鏈內互補結構的Tm值

分子信標的缺點時除了考慮probe與模板的Tm 值外，還必須考慮自身鏈內互補結構的Tm{宜

定量PCR討論 • 2002年發生於中國廣東的SARS冠狀病毒的確認 • 1981年得知HIV病毒的存在，1984年才確認感染的病毒 • 因PCR技術的成熟，短短數週的時間就將整個病毒確認及定序完成 • 基因的比對中，確定宿主是果子狸 • PCR非常靈敏，然而影響PCR的效率也有很多因素 • Mgl2的濃度，各種不同的抑制劑，及primer本身及濃度問題....等 • 檢體DNA及RNA的萃取也是非常重要

量的分析 • 因PCR是以DNA為材料的方法，所以必須將有量變化的RNA反轉錄成cDNA • 因為RNA隨時都會被破壞很不穩定 • 檢體必須新鮮乾淨，盡快將RNA萃取出來，反轉錄成Cdna • cDNA的量要真正能反應樣本原來RNA的量 • 實際上不能將原本樣本的RNA百分百反轉錄成Cdna • 做RT-PCR時的reverse transcription階段，好的RT就很重要 • 有時樣本待測的目標序列複本數少時，更高靈敏度及特異性的RT才能偵測出來 • 以SARS為例: 發病一、二天的喉頭檢體病毒量很少時，因為檢體試劑的敏感度及特異性問題可能會產生false-negative，所以產生了SARS的（初期發病？）階段RT-PCR的偽陰性反應

理論上只要十幾、二十幾個病毒量(copy number)就應該可以偵測出來 • 但因反轉錄成cDNA受某些因素影響不能達到百分之百的效率 • 一般都必須等到發病後一星期左右才能偵測出來 • 如何提高發病早期偵測病毒的靈敏度，這在控制病毒傳播上是非常重要 • Real-time PCR按照“閥值(Ct) ”的概念，利用反應進入指數增加期的閥值做為定量的標準，機器本身的再現性及靈敏度較高

量分析的標準化 • 定量PCR時，在指數增加期才有量變化上的意義 • 此時螢光強度與模板股的複本數成正比 • 做一系列濃度稀釋的圖形 • 可做5倍或10倍稀釋，因為含量都是已知，所有的condition都一致，而且標準樣本與待測樣本的PCR效率也一樣，螢光強度就與樣本的濃度成正比

量分析的修正 • 反應條件下都一樣的情況下，只要做一系列已知濃度稀釋的標準圖形，我們就可以利用標準圖形，得知待測目標序列相對的量變化 • 但樣本RNA的萃取在RNA含量及含量純化方面，再現性有問題 • PCR的擴增情形並不是就反應樣本中RNA的其實情況 • 有些RNA的成員可能被擴大，而複本數少的RNA可能又被忽略 • 每一次做PCR效率可能都不一樣 • 管與管之間的效率也會有差異 • 每次取的量也可能有誤差 • 必須加內標加以校正，這樣前後量的變化就不會因為各種因素的影響，而使結果不能分析 • 內標的存在可以減少污染導致的偽陽性或偽陰性

校準的方法 • Competitor • 在試管內合成一段與待測序列使用同組引子，有相同效率且量是已知的序列，加入待測基因裡面，做為參考校正指標 • 表現量穩定的基因 • 有些基因的表現量在組織很穩定，不會受外來影響而有變化 • 作為參考校正指標，也可監測PCR的效率 • 如: housekeeping gene 在定量的組織裡有一定的表現量，不會因為外在的刺激而有量的變化 • Internal dye reference • 機型內建參考螢光修正指標， ( A passive dye reference ROX) ，當成背景螢光，也就是在做PCR時產物的螢光要大於背景螢光，這時產物的螢光強度才會被偵測出來，超過了背景螢光，可以被偵測出來時就稱為 Ct，ABI使用ROX方式，也可以校正每次取量的誤差( pipetting error)

相對定量relative quanlity • 以內標來標準化所加入的待測樣本 • 內標儘量選擇做PCR的效率與待測樣本接近的housekeeping gene 如: 18S Rrna、GAPDH、beta-actin • 分析基因表現量差異 • 相對定量的標準化 ~Ct :是一個常數( constant value) • 如果PCR的效率在二個系統中是相等，系統中的A基因與B基因Ct值的差，在二個系統是一樣的

各種疾病的分子基礎