Biologie mol culaire
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Biologie Moléculaire. Compétences Techniques. Compétences. Micropipetage Préparation de solutions Travailler avec les concentrations Dilutions Quantités Électrophorèse sur gel d’agarose. 2-20 µL 50-200 µL 100-1000 µL Max. 0.02 mL0.2mL1mL.

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Biologie Moléculaire

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Presentation Transcript


Biologie mol culaire

Biologie Moléculaire

Compétences Techniques


Comp tences

Compétences

  • Micropipetage

  • Préparation de solutions

  • Travailler avec les concentrations

  • Dilutions

  • Quantités

  • Électrophorèse sur gel d’agarose


Micropipetage mesurer de petits volumes

  • 2-20 µL 50-200 µL 100-1000 µL

    Max. 0.02 mL0.2mL1mL

Micropipetage- Mesurer de petits volumes

  • Permet la mesure de microlitres (µL)

    • 1 000 X moins que 1 millilitre


R glage du volume p20

Réglage du volume- P20

Dizaines (0, 1=10 or 2=20)

Unités (0-9)

Décimale (1-9 = 0.1-0.9)


R glage du volume p200

Réglage du volume- P200

Centaines (0, 1=100 ou 2=200)

Dizaines (0, 1-9=10-90)

Unités (1-9)


R glage du volume p1000

Réglage du volume - P1000

Milliers (0, 1=1000)

Centaines (0, 1-9=100-900)

Dizaines (0, 1-9=10 - 90)


Utilisation du micropipetteur

Étape 3

Insérer embout dans la solution a être prise

Étape 1

Insérer embout

Étape 2

Peser piston

jusqu’au

Premier arrêt

Étape 5

Retirer pipetteur

Utilisation du micropipetteur

Étape 4

Aspirer l’échantillon en

relâchant lentement le piston


Livraison

Livraison

Commencer à livrer 1er arrêt =livrer 2e arrêt = expulsion


Directives pour reproductibilit optimale

Directives pour reproductibilité optimale

  • Utiliser le pipetteur dont le volume se rapproche le plus de celui désiré

  • VITESSE et FORCE consistante pour peser et relâcher le PISTON

  • PROFONDEUR D’IMMERSION consistante

    • 3-4mm sous la surface

  • EVITER les bulles d’airs

  • Ne jamais aller au-delà des limites du pipetteur


Pr paration des solutions

Préparation des Solutions


D finitions

Définitions

  • Solution

    • Mélange de 2 substances ou plus dans une phase unique

    • Solution composée de deux composantes

      • Soluté

        • Partie qui est dissoute ou diluée – Habituellement la plus petite quantité

      • Solvant (OU Diluent)

        • Partie de la solution dans laquelle le soluté est dissout – Habituellement le plus grand volume


Concentrations

Concentration = Quantité de soluté

Quantité de solution (Pas solvant)

Trois façons d’exprimer les concentrations:

Concentration Molaire (Molarité)

Pourcentages

Masse par volume

Concentrations


Molarit

Molarité

  • No de Moles de soluté/Litre de solution

  • Masse de soluté/PM de soluté = Moles de soluté

  • Moles de soluté/vol en L de solution= Molarité


Pourcentages

Pourcentages

  • Les concentrations en pourcentage peuvent être exprimé en tant que :

    • V/V – volume de soluté/100 mL de solution

    • M/M – Masse de soluté/ 100g de solution

    • M/V – Masse de soluté/100 mL de solution

  • Tous représentent des fractions de 100


Pourcentages suite

Pourcentages (suite)

  • %V/V

    • Ex. 4.1L soluté/55L solution =7.5%

      • Doit avoir les mêmes unités en haut et en bas!

  • %M/V

    • Ex. 16g soluté/50mL solution =32%

      • Dois avoir des unités du même ordre de grandeur en haut et en bas!

  • % M/M

    • Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9%

      • Dois avoir les mêmes unités en haut et en bas!


Les dilutions

Les Dilutions

La Réduction d’une Concentration

Une Fraction


Dilutions

Dilutions

  • Dilution = produire des solutions plus faibles à partir de solutions plus fortes

  • Exemple : Faire du jus d’orange à partir de concentré. Mélanger une cannette de concentré de jus d’orange congelé avec trois (3) cannettes d’eau


Dilutions suite

Dilutions (suite)

  • Les dilutions sontexpriméescomme le volume de la solution étantdiluée par le volume total final de la dilution

  • Dansl’exemple du jus d’orange, la dilution seraitexpriméecomme 1/4, pour unecannette de jus à un TOTAL de quatrecannettes de jus dilué. Quand on parle de la dilution, vousdiriez pour l’exemple du jus : « un dansquatre ».


Dilutions suite1

Dilutions (suite)

  • Un autre exemple :

  • Si vous diluez 1 ml de sérum avec 9 ml de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou dite « un dans dix », car vous exprimez le volume de la solution étant diluée (1 ml de sérum) par le volume final TOTAL de la dilution (10 ml totaux).


Dilutions suite2

Dilutions (suite)

  • Un autre exemple :

  • Une (1) partie d’acide concentré est diluée avec 100 parties d’eau. Le volume total de solution est 101 parties (1 partie d’acide + 100 parties d’eau). La dilution est écrite comme 1/101 ou dite “un dans cent un ”.


Dilutions suite3

Dilutions (suite)

  • Remarquez que les dilutions n’ont pas d’unités (cannettes, ml, ou parties) mais sont plutôt exprimées comme un nombre par rapport à un autre nombre

    • Exemple : 1/10 ou « un dans dix»


Dilutions suite4

Dilutions (suite)

  • Les dilutions sont toujours exprimées avec la substance originale étant diluée comme étant un (1). Si plus d’une partie de la substance originale est initialement utilisée, il est nécessaire de convertir la partie de la substance originale à un (1) quand la dilution est exprimée.


Dilutions suite5

Dilutions (suite)

Exemple:

Deux (2) parties d’un colorant sontdiluées avec huit (8) parties de diluant. Le volume total de solution est 10 parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La dilution estinitialementexpriméecomme 2/10, mais la substance originaledoitêtreexpriméecommeétant un (1). Pour convertir le volume original à un (1), utiliseruneéquation de rapport et de proportion. Rappelez-vousque les dilutions sontexprimées en terme de 1 à quelque chose :

__2 parties de colorant = ___1.0___

Volume total de 10 parties x

2 x = 10

x = 5

La dilution estexpriméecommeétant 1/5.


Dilutions suite6

Dilutions (suite)

La dilution n’est pas toujourscomme des nombresentiers.

Exemple:

Deux parties (2) de sang sontdiluées avec cinq (5) parties de saline. Le volume total de solution estsept (7) parties (2 parties de sang + 5 parties de saline). La dilution serait 2/7, ou plus précisément 1/3.5. Encore unefois, ceciestcalculé en utilisantuneéquation de rapports et de proportions. Rappelez-vousque les dilutions sontexprimées en terme de 1 à quelque chose:

__2 parties de sang_____ = ___1.0___

Volume total de 7 parties x

2 x = 7

x = 3.5

La dilution estexpriméecomme 1/3.5


Qu est que cela veut dire

Qu’est que cela veut dire??

  • Si une solution possèdeune dilution de 1/10 le nombrereprésente 1 partie de l’échantillonajouté à 9 parties de diluant.

  • Si cette solution étaitpréparée à un volume final de 110 mL, quels volumes de soluté et de solvent doiventêtreutilisés?

  • Cecireprésente 1 partied’échantillonajoutée à 9 parties de diluant.

  • En autresmots, quelest le volume de 1 partie et de 9 parties?


Facteur de dilution

Facteur de Dilution

  • EXEMPLE: Quelest le facteur de dilution sivousajoutez 0.1 mL d’un spécimen à 9.9 mL de diluant?

    • Le volume final estégal au volume de l’échantillon PLUS le volume du diluent: 0.1 mL + 9.9 mL = 10 mL

    • Le facteur de dilution estégal au volume final diviser par le volume de l’échantillon : 10 mL/0.1 mL = Facteur de dilution de 100X


Exemple d un probl me

Exemple d’un Problème

  • Quel est le facteur de dilution quand 0.2 mL est ajouté à 3.8 mL de diluant?


Dilutions en s rie

Dilutions en série

  • Si une dilution de 1/8 d’une solution mèreestfaitesuivie par une dilution de 1/6 quelleest la dilution finale?

  • La dilution finale est: 1/8 x 1/6 = 1/48


Dilutions1

Dilutions

  • Moyen de réduire une concentration

    • Dilution: Une fraction du facteur de dilution

Facteur de dilution = Conc. que j’ai

Conc. que je veux

Ex. Vous avez une solution de 25 mg/mL et désirez une solution de 5mg/mL

Facteur de dilution = 25mg/mL

5mg/mL

= 5X

Dilution = 1/le facteur de dilution = 1/5 = 1 partie/5 parties Totales


Exemple

Exemple

  • Comment est-ce que vous prépareriez 25 mL d’une solution de 2mM à partir d’un mère de 0.1M


Quantit s

Quantités

  • Les quantité ne sont PAS égales aux concentrations!

    • Ex 1.

      • Deux pommes par sac = une concentration

      • Deux pommes = une quantité

    • Ex 2.

      • 10g par 100 mL = une concentration

      • 10g = une quantité


D une concentration aux quantit s

D’une concentration aux quantités

  • La concentration indique la quantité dans un volume donné

    • Ex. 1mM = 1millimole par chaque litre

    • Donc la quantité dans 1 L est 1 millimole

    • Quel volume de la solution auriez vous besoin pour avoir 0.05 millimoles?


Lectrophor se sur gel d agarose

Électrophorèse sur Gel d’Agarose

  • Séparation de molécules d’acides nucléiques simples ou doubles brins d’après leur taille et leur conformation

    • Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp

    • Pouvoir de résolution entre fragments ≥100pb


Migration sur gel d agarose

Puit

Linéaire

Relâché

Direction de

migration

Super enroulé

8

Migration Sur Gel d’Agarose

Haut (-)

Bas (+)


Que peut on d terminer d une lectrophor se sur gel d agarose

Que peut-on déterminer d’une électrophorèse sur gel d’agarose?

  • Est-ce qu’il y a de l’ADN

  • Combiens de conformations

  • Combien de fragments

    • Taille des fragments

    • Taille totale des molécules d’acides nucléiques

    • Nombre de coupures

      • Linéaire?

      • Circulaire?


Profil de migration sur agarose

Résolution

Résolution

1.0%

Log de la taille

1.5%

Distance de Migration

Profil de Migration sur Agarose


D terminer les tailles

Déterminer les tailles

Taille (pb) Distance (mm)

23,00011.0

9,40013.0

6,50015.0

4,40018.0

2,30023.0

2,00024.0


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