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线虫的遗传实验

线虫的遗传实验. —— 利用 RNA 干扰（ RNAi） 进行基因沉默，研究基因与发育的调控. 线虫. 通常所说的线虫特指秀丽隐杆线虫( Caenorhabditis elegans) 是一种很小的蠕虫。 秀丽隐杆线虫成体长仅1 mm， 全身透明，以细菌为食，居住在土壤中，全身共有959个细胞，性别为雌雄同体或雄性。 线虫整个的生命周期仅3天。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。. RNAi 的 发现. double stranded RNA. Neg. control Uninjected. sense.

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线虫的遗传实验

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Presentation Transcript

  1. 线虫的遗传实验 ——利用RNA干扰（RNAi）进行基因沉默，研究基因与发育的调控

  2. 线虫 • 通常所说的线虫特指秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一种很小的蠕虫。 • 秀丽隐杆线虫成体长仅1mm，全身透明，以细菌为食，居住在土壤中，全身共有959个细胞，性别为雌雄同体或雄性。 • 线虫整个的生命周期仅3天。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。

  3. RNAi的发现 double stranded RNA Neg. control Uninjected sense antisense inject Antisense RNA dsRNA Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization C. elegans Nature 1998 391:806-811

  4. dsRNA Dicer endonuclease 21-23 bp siRNA find complementary mRNA (RISC complex) destroy mRNA RNAi原理 当双链RNA进入细胞后，能与类似RNase Ⅲ的Dicer结合，随即被切割成21～23个碱基的siRNA。siRNA与RISC(RNA induced silencing complex)结合，若双链5'端未被磷酸化，则会启动其磷酸激酶活性，将其磷酸化并被解螺旋。反义链RNA与RISC结合后将其内切酶活性激活，激活的RISC在细胞质中寻找能与反义RNA同源的mRNA，并在双链的中心部位、距双链RNA 5'端第10个碱基处将其切割，从而使mRNA降解。

  5. 目的意义 • 构建RNAi表达载体，学习分子克隆技术 • 通过对线虫进行基因unc-22的RNAi实验，认识RNAi的作用及意义 • 学习用RNAi 技术分析基因的功能

  6. 实验材料与器材 • 线虫株：N2 或rrf-3 • 菌株：DH5a和HT115(DE3) • RNAi 表达载体:pPD129.36 • 线虫培养用具 • BamHI、 HindIII限制酶及 10×K buffer • T4 DNA 连接酶及其缓冲液(Takara,350u/l) • TBE缓冲液(10×) • 溴化乙啶染色液(10mg/ml) • 电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等

  7. 实验原理 • 当需要被干涉的基因克隆到载体pPD129.36后，转化到HT115（DE3）菌株，该菌株含T7 RNA聚合酶，并且RNase Ⅲ缺陷。这样当加入IPTG后，在菌株内就会形成双链RNA，当把线虫饲养到培养有这种菌株NGM平板上后，就产生RNA干涉的效果，线虫从野生型变成卷曲状，运动失调。

  8. 实验方法 • RNAi载体pPD129.36－unc22的构建 PCR产物的纯化 PCR产物以及空载体的酶切 乙醇沉淀 电泳检测 连接 转化及筛选阳性克隆

  9. RNAi 平板的准备 （1）倒板：RNAi平版的配制方法是在标准的NGM平板配方中加入终浓度为100mg/ml的AMP和1mM/ml的IPTG； （2）将转化有pPD129.36-unc22的HT115菌培养至OD=0.4时铺板，平行做几组并以转有空载体的HT115菌做对照

  10. RNAi 挑20只L4大小的rrf-3线虫于每个RNAi平板，20℃培养

  11. 结果与分析 • 在显微镜下观察子代表型，并统计结果 • 分析基因unc-22的可能功能

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