BMP5748 – 2011 Exame Nome:_____________________________________________

1. BMP5748 – 2011 Exame Nome:_____________________________________________ 1. Desenhe oligonucleotideos complementares para inserir direto (sem PCR) a seguinte sequência no sítio BamH1 do gene mostrado, resultando numa versão híbrida e funcional do gene ( mantendo a fase de leitura, os codons estão indicados em tripletts). Sequência a inserir (HA tag): 5' TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT3‘ Sequência gene alvo (clonadoemvetorpGEM T easy): 5’ ATG CCA TCA ACT GGG TGT TCT AAC TCA TCC CCG ACT TTT AAA CAT GAG CTG CAG ATC ATG GCG GAT CCG CTA CAG TTC GGT GGG CTA TCA AGG CTC CAG CTT GTT ACG ATT CTT ATA CCA TAG 3’ 2. O organismoTrypomodiumcansativum é um parasitaintracelularque invade, se multiplica e assimdestroilinfócitosdaonçaparda, levandoassim à sindrome de imunodeficiencia e morteprecocedeste animal. No parasitafoidescobertaumafamiliamultigenica (Tc_var) de 100 membrosquecodificaantígenosimportantesnainvasão. Devidoaoseutamanho, estesantigenospodem ser classificadosem 10 classes (A-J) quediferemem 3-4 kDa de umaclassepara a outra. Vocêestudaestesantigenos/genes (modelo do gene am A). Tendoemmãostodosos genes clonados e um anticorpo contra a porçãoconservada das proteinas (A), vocêfazprimeiramenteumaanálisedaregulação de transcrição (B) e expressão dos antígenos (C) de parasitasrecolhidos e recebe o seguinteresultado: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B C D E F G H I J * epitopo do anticorpoantiTC_var A N-terminoconservado Ectodomíniopolimórfico TM dominioconservado Western blotusingantiTC_var C B Microarray with polymorphic domains amplified with oligos * each class with 10 members 120 kDa 110 kDa 100 kDa 90 kDa 80 kDa 70 kDa A B C D E F G H I J Size range ofTC-varproteins classes

2. Continuação 2: Interprete os resultados relativos a transcrição e tradução de proteínas Tc_var. 3. Vocêfaz um nuclearrun-on assaycom o mesmo material de parasitas de pergunta 2 e recebe o resultadoabaixo. A) Descreva brevemente como o ensaio funciona tecnicamente. B) O quevocêconcluipara a transcrição dos genes TC_var? Microarraypolymorphicdomains eachclasswith 10 members classes 4. Tentando descobrir mecanismos que influem neste modo de expressão de genes TC_var, consegue knockouts em 2 genes potencialmente envolvidos na regulação da transcrição de TC_var. A partir de material de parasitasknockouts você mede transcrição por microrarray e expressão de proteinas como feito em 2 B e C. Parasita knockout no gene MLE (multiple ligands expressed) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B C D E F G H I J A B C D E F G H I J A Microarraypolymorphicdomains eachclasswith 10 members Western blotusingantiTC_var B 120 kDa 110 kDa 100 kDa 90 kDa 80 kDa 70 kDa A B C D E F G H I J classes

3. Parasita knockout no gene CAP1 (chromatin associated protein 1) C Microarraypolymorphicdomains eachclasswith 10 members D Western blotusingantiTC_var 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 120 kDa 110 kDa 100 kDa 90 kDa 80 kDa 70 kDa A B C D E F G H I J A B C D E F G H I J classes A partir dos resultados 4 A-D, sugira uma função para MLE e CAP1. Respostas corretas 1. O desenho dos oligosdeveconsiderar a sequência e fase de leitura no 5’ (paraficarnafase com o gene ondeseráinserido o HA tag) e 3’ do sitio BamH1 (paracontinuarnafase de leitura no gene ondeseráinserido o HA tag). Sendoassim, a sequênciacom HA tag inseridadeve ser (trêsletras juntas um codon) 5’-GCG GAT CCG TAC CCA GAT GTT CCA GAT TAC GCT GCG GAT CCG C-3’ . Note que os nts sublinhados servem para manter a fase de leitura. Como temos pouca BamH1 no lab, vou desenhar 2 oligos que hibridados já formam um sitio BamH1 clivado (assim os oligos tb são mais curtos! Tem a desvantagem que vou ter que fosforilar os oligos no 5’ antes de usar , tudo bem): 5’- GAT CCG TAC CCA GAT GTT CCA GAT TAC GCT GCG (fita sense) 5’- GATCCGC AGC GTA ATC TGG AAC ATC TGG GTA CG -3’ (fita antisense) 2. Nos rersultados do microarray que revela a presença de transcritos (e se for ainda possivel uma densitometria dos spots que não enxergo aqui poderia ver até a quantidade de cada transcrito) podemos ver que vários genes Tc_var apresentam transcritos, especificamente das classes B, D, F, H, I. Em outras palavras, se todos os genes Tc_var forem representados no array, o organismo possui naquele momento 7 transcritos Tc_var diferentes (B3, B9, D6, F3, H7, H9, I2). No Western blot onde uso um anticorpo contra a parte conservada das proteinas (assumo que a performance deste ac é igual para todas as proteinas TC_VAR), vejo apenas uma banda na altura das proteinas da classe D, ou seja, é muito provavel que apenas a proteina TC_VAR D6 esteja presente no parasita – já que dessa classe apenas um gene apresentou transcrito. Temos aqui algum controle póstranscripcional na expressão de genes Tc_var que suprime a tradução dos transcritos.

4. 3. No nuclear run-on é testada a presença de transcrição ativa e não de transcritos prontos como no Northernblot ou num microarray onde utiliza –se cDNAmarcado como sonda. O procedimento inclui o isolamento de núcleos intactos, que são incubados com NTPs radioativamente marcados no alfa-32P. Assim, o RNA que estava sendo transcrito neste momento no nucleo é radioativamente marcado e após purificação com métodos adequados (extração com fenol/trizol e precipitação) pode ser utilizado como sonda num “microarray radioativo”, neste caso usaria um dot-array com representantes Tc_varespotados como mostrado já em tarefa 2. Assim cada transcrito nascente hibridaria com um spot do referente Tc_var do array(previamente desnaturado para estar em “singlestrand”). Já o resultado deste ensaio me mostra que os mesmos genes dos quais vi transcritos num microarraycomum também vejo transcritos nascentes. Ou seja, transcritos que estão presentes de fato são produzidos naquele momento (e não anteriormente), e há de fato 7 loci dos quais nascem estes transcritos. 4. No knockout do gene MLE vejo uma derepressãode tradução, ou seja: todos os transcritos presentes parecem ser traduzidos (tem sinal no Western!) com a ressalva que o Western não me resolve se os dois genes Tc_var classe H de fato são traduzidos. Me parece que o MLE pode ser uma RNAs/DEAD boxHelicase, semelhante a DHH1 de T cruzi ou DOZI de P. berghei, ela recrutaria os mRNAs de Tc_var. Mas por que ela não reprime a tradução de um único RNA no wildtype (que é traduzido), eu não sei. Já o CAP1 parece exercer uma função de repressor de transcrição, mas não de todos os genes Tc_var, já que não reprime alguns genes transcritos no wildtype. No knockout, todos os genes são transcritos e com a presença de MLE, que provavelmente recrutou os transcritos evitando tradução. Entretanto, como antes, apenas um único transcrito é traduzido (uma banda no Western). A transcrição de Tc_var me parece muito complexo e faltam vários componentes a serem identificados para montarmos um modelo consistente. Por exemplo, quem licencia loci para serem transcritos na presença de CAP1? Ou ainda, quem licencia transcritos feitos para serem traduzidos na presença de MLE?

5. Classificação final curso 2011 As notas finais foram atribuidas da seguinte maneira: Todo mundo que participou todos os dias e estava presente na avaliação automaticamente alcança conceito C. Pontuação no exame entre 0 e 1,33 pontos resulta em conceito C, entre 1,34 e 2,66 fica com conceito B, e acima 2,66 é conceito A. Em nenhum caso foram descontados pontos por faltas.