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实验 三、 PCR 产物的克隆

实验 三、 PCR 产物的克隆. 一、实验目的 学习和掌握从 PCR 产物中回收 DNA 片段的方法。并了解从琼脂糖凝胶中纯化 DNA 片段的有关技术。 掌握 DNA 重组方法。通过本实验了解 DNA 重组技术在分子生物学研究中的重要意义。 二、实验试剂及材料 PCR 产物（ Taq ，非 Pfu ）， pUCm-T 质粒 , E. coli DH5α Dl2000 DNA Marker, T4 噬菌体 DNA 连接酶 (5 单位 ) 琼脂糖， T4 DNA ligase 及其缓冲液 TAE 缓冲液 (10×) ，溴化乙啶染色液 (10mg/ml)

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实验 三、 PCR 产物的克隆

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Presentation Transcript

  1. 实验 三、PCR产物的克隆

  2. 一、实验目的 学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法。并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术。 掌握DNA重组方法。通过本实验了解DNA重组技术在分子生物学研究中的重要意义。 二、实验试剂及材料 PCR产物（Taq，非Pfu），pUCm-T 质粒,E. coli DH5α Dl2000 DNA Marker, T4噬菌体DNA连接酶(5单位) 琼脂糖，T4 DNA ligase 及其缓冲液 TAE缓冲液(10×)，溴化乙啶染色液(10mg/ml) 凝胶回收DNA试剂盒II（安徽优晶生物公司） 上样液(6×): 0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液

  3. 6、按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。7、TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 ８．麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后涂板。

  4. 三、实验器材 恒温水浴锅、PCR仪、台式低温离心机、移液枪、恒温培养箱、电泳仪、研钵、紫外分光光度计，一次性手套。涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。

  5. 三、实验原理 1、目的DNA片段的纯化： DNA纯化的主要目的是回收得到纯的目的DNA片段，去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段的试剂盒，有效地加快了DNA的纯化的速度。

  6. 2、DNA重组 DNA重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段通过DNA连接酶的的作用插入到质粒载体中的过程。 DNA片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进行复制。通过此方法可以对单个基因的功能进行研究。 本实验是将具有PCR产物以及T载体通过DNA连接酶连接起来。

  7. 连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即12~16℃。连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即12~16℃。

  8. 载体的选择： 因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及酶切位点等方面的问题。

  9. 多克隆位点 polylinker 复制起始点 ori Amp 遗传标记 基因载体

  10. 载体及插入片段的量 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。

  11. DNA连接酶 主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。E. coli DNA 连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。T4噬茵体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步。

  12. pUCm-T 生产厂家：生工 原始载体：pUC系列 宿主菌：实验室常用E. coli菌株如DH-5α 抗性：AMP 拷贝数：高 蓝白斑筛选：可以 测序引物：M13 注：本实验室自制T载体与此相同。 *PCR的扩增引物5’为A可以大大提高PCR后的加A效率有利于PCR产物的T-A克隆

  13. Promaga T-载体和Teasy 载体图

  14. 质粒DNA的抽提原理 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤: 培养细菌使质粒扩增; 收集和裂解细胞; 分离和纯化质粒DNA。 采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。

  15. 四、实验步骤 1、DNA片段回收； 在紫外灯下将含目的片段的凝胶条带割下(凝胶条尽量窄，DNA在紫外灯下时间不要超过30秒注意防护眼睛等），置于1.5ml管中，根据凝胶重量加入等体积NJ缓冲液(胶密度以g/ml计)，用力振摇后于60℃温浴到胶熔化（约7分钟），期间振摇或旋涡混匀2分钟。将Mu-Pu回收柱放入一收集管中，转入样品至柱上，室温放置1min，10000g离心1min，去除收集管中溶液，加入700μl SPW洗涤溶液到柱中,室温放置2min, 10000g离心1min ；把空柱10000g离心1min以甩干柱基质残余的液体；将柱放入一新(灭菌干净）的1.5ml管中，在柱上加入50μl TE或无菌水，放置1min，离心1min回收DNA。得率约70％。

  16. 2、PCR产物与T-Vector的连接： 将按载体：待插入DNA片段＝1：3（摩尔）混合于一管中（载体可用50-100ng，对于本实验约1 µ l载体，7 µl DNA片段，根据电泳结果来判断 ） ，加入T4 DNA连接酶缓冲液1µl，最后加T4噬菌体DNA连接酶1µl(5单位)，一般掌握在总体积10 µl，于16℃保温 14～16h（过夜）， 应迅速作转化实验，如遇到特殊情况，可先置于-20oC保存。 然后，通过转化细菌来鉴定反应连接产物。

  17. 3、大肠杆菌DH5a感受态细胞制备及质粒转化： 按1:100比例将过夜菌加入到新鲜的LB中，37℃培养至OD590为0.375。50ml一管分装，在冰上放置5—10min。4℃1600g离心7min，沉淀菌体。用10mlCaCl2重悬菌体。4℃ 1100g离心5min。10ml CaCl2重悬菌体，冰上放置30min。4℃ 1100g离心5min。用1ml CaCl2重悬菌体，按100ml一管分装于－70℃保存。一管感受态菌加入2-5μl连接产物冰上放置30min。将管放入42℃水浴1min进行热休克，然后加入900ml SOC培养基37℃ 225rpm培养1hr。于青霉素抗性平板上筛选单一菌落。麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。

  18. 4、质粒DNA的碱法抽提:1、在平板上选择一个单菌落接种到LB液体培养基（含50μg/ml氨苄青霉素），37℃下225rpm培养16hr，取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。重复一次。7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心5分钟。 　　

  19. 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，溶解后37℃处理30min。取2μl质粒电泳检测质量及浓度。质粒送公司测序。

  20. 5、重组质粒的电泳检测和酶切鉴定 重组质粒DNA λ -DNA dl2000 空T-Vector 有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较空pUCm-T慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。

  21. 学生PCR实验结果(4l) PCR 产物纯化后(相当于0.8 l原PCR产物） pBluescript 酶切后 PCR 纯化并酶切后 (2l)

  22. 测序结果 一、抽质粒及电泳检测浓度估计 A Ｂ Ｃ Ｄ pbssk-in(1)(2) Marker D A Marker 和样品进样量为5ul.胶不要太厚,电泳时间15-20分钟;测序浓度要求50ng/ul,,需要5ul

  23. L29-m-PCR( A):340bp: 引物序列L29-m :up: 5’-TgCgTgTTCgCgCCCTACTT-3’; low:-5’-gCCACCTgCGTCTTCgCCTg-3’ TCCGTAATAGAACTACTATAGGGCGACATATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTGCCACCTGCGTCTTCGCCTGCGCCACCTGCACCTGCAGCGTCGCCAGCTGCGGCATCCGTGTGCTAAGTTAGCTCGCCGGCGAGTGATCGATCGATCGCGAGGGGTTTAAGAATTTGTAATTACCTGCTGCTGCAGCGCGAAGATGTGGGCGACGCAGCCGTAGACGGGGTCGCGCAGCCTGGCCTGCGCCTCGTAGGTGACGGTGGCGGCGACCTCGCTCCGGTCGCCCGGCGCCACCTGCTGCAGCAGCTTCGCCGCGTTGCTGGCGCCGAACACCTTGTGTATCGCCGCGAACTGCGCCGCCCCGTCCTCCGCGCAGAAGTAGGGCGCGAACACGCAAAGACTGGAGATCTGGATCCCTCGAGTCTAGAGTCGACCT L29－ORF片断（340bp）反向插入T载体 Absent enzymes sites:kpnI, EcoR I, Nde I, Cla I,NotI, NcoＩ，EcoR V Xho I, XbaI,BamH I,HindIII,Bgl II, Pae I

  24. 二、A和 D的测序结果,DNAstar工具确定插入方向 L29-PCR( D)-T载体测序:550bp; 引物序列L29 :up:- 5’-gctgccaatggcgtcgtcggg-3’; low:-5’-TCATTCCTCCTgCTCgCCgAA-3’ CTTACGGTAACGACTCACTATAGGGCGACATATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTGCTGCCAATGGCGTCGTCGGGAGTGGGCGGCGTGCCGGGGTCGCCGTGCGGGGCGTGCAAGTTCCTGCGGCGCAAGTGCGCGGCGGAGTGCGTGTTCGCGCCCTACTTCTGCGCGGAGGACGGGGCGGCGCAGTTCGTGGCGATACACAAGGTGTTCGGCGCCAGCAACGCGGCGAAGCTGCTGCAGCAGGTGGCGCCGGGCGACCGGAGCGAGGTCGCCGCCACCGTCACCTACGAGGCGCAGGCCAGGCTGCGCGACCCCGTCTACGGCTGCGTCGCCCACATCTTCGCGCTGCAGCAGCAGCTGGCGACGCTGCAGGTGCAGGTGGCGCAGGCGAAGACGCAGGTGGCGCAGACGCTGGCGGCGGCCGGCATGCTGACGGCTGGGAACCCTCTCCTTCAGCATCAGCAGCAGCAGCAGCAGGCGTGGCAGATTGAGCACGAGTCGACGATGACCTCGACGCAGAGCTCCGGCTGCTACAGCGCGCCGCGCTCCGACGGGTCGACGTCGCTGCAGGACATGTACTGCTTCGGCGAGCAGGAGGAATGAAAGACTGGAGATCTGGATCC

  25. L29-基因ORF序列543bp，正向插入T－载体 ATGGCGTCGTCGGGAGTGGGCGGCGTGCCGGGGTCGCCGTGCGGGGCGTGCAAGTTCCTGCGGCGCAAGTGCGCGGCGGAGTGCGTGTTCGCGCCCTACTTCTGCGCGGAGGACGGGGCGGCGCAGTTCGTGGCGATACACAAGGTGTTCGGCGCCAGCAACGCGGCGAAGCTGCTGCAGCAGGTGGCGCCGGGCGACCGGAGCGAGGTCGCCGCCACCGTCACCTACGAGGCGCAGGCCAGGCTGCGCGACCCCGTCTACGGCTGCGTCGCCCACATCTTCGCGCTGCAGCAGCAGCTGGCGACGCTGCAGGTGCAGGTGGCGCAGGCGAAGACGCAGGTGGCGCAGACGCTGGCGGCGGCCGGCATGCTGACGGCTGGGAACCCTCTCCTTCAGCATCAGCAGCAGCAGCAGCAGGCGTGGCAGATTGAGCACGAGTCGACGATGACCTCGACGCAGAGCTCCGGCTGCTACAGCGCGCCGCGCTCCGACGGGTCGACGTCGCTGCAGGACATGTACTGCTTCGGCGAGCAGGAGGAATGA Absent enzymes sites:kpnI, EcoR I, Nde I, Cla I,NotI, NcoＩ，EcoR V Xho I, XbaI,BamH I,HindIII,Bgl II, Pae I

  26. Cla I EcoR V Nco I Not I PstI Xba I Sal I Pst I Hind III EcoR I Nde I Bgl II BamH I BamH I M13 Reverse Primer T7-promoter PCR Product

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