Cold-PCR & Droplet Digital PCR

1. Cold-PCR &Droplet Digital PCR

2. ”Fortynding” af cancer med normale celler Cancercelle ”fortyndet” i normale celler

3. Cold-PCR vs konventionel PCR

4. Lightscanner & heteroduplexprincip Heteroduplexer Homoduplexer A T A T G C A C G T G C

5. Fortyndinger og LightScanner resultater Ved forbrug af 50ng DNA/reaktion vil forholdet mellem WT kopier og variant DNA kopier være følgende: 1:1 - 50% - 8325/8325 kopier 1:10 - 10% - 14985/1665 kopier 1:20 - 5% - 15818/833 kopier 1:40 - 2,5% - 16234/416 kopier 1:80 - 1,25% - 16442/208 kopier 1:160 - 0,625% - 16546/104 kopier 1:320 - 0,3125% - 16598/52 kopier

6. Konventionel PCR – fortynding 1:20 Cold-PCR – diverse fortyndinger Sekventering af fortyndingerKonventionel vs Cold-PCR 10% 5% 2,5% 1,25% 0,625% Konventionel PCR – heterozygot 1:1

7. Reference-artikelCoren A. Milbury et al. Clin.Chem.

8. Droplet Digital PCR Introduktion

9. FRET FRET FRET Match Mismatch FRET Taqman-prober til detektion (1)

10. SNP: A  T VIC FAM FRET FRET T A A T Taqman-prober til detektion (2)

11. Taqman kromatogram (3)

12. Droplet Digital PCR – 3rd Generation af PCR Real-time PCR Relativ Kvantificering Droplet Digital PCR Absolut Kvantificering 2nd 3rd 1st PCR Kvantificering

13. Droplet Digital PCR Workflow Lav Droplets PCR Droplets Aflæs Droplets • Mix reagenser og prøver i 20,000 droplets • Udfør PCR på termocycler • Kvantificer target DNA/RNA ved at tælle prøve-droplets via fluorescence-signal • Digital aflæsning giver absolut måling af target DNA

14. Produktion af Droplets Ensartede droplets Placer engangs cartridge med prøver og droplet-olie i QX100 Droplet Generator 20,000 droplets per prøve, 2 ½ min for 8 prøver

15. Droplets på PCR maskine Overfør emulsion til 96-brønds PCR plade Forskellige experimenter på samme plade Er ikke låst fast i specifikke PCR protokoller, men kan tilpasses det ønskede target

16. Aflæsning af Droplets • Load 96-pladen i QX100 Droplet Readeren • Autosampler håndterer den enkelte prøve uafhængigt • Droplets ledes forbi optisk detector, der detekterer flourescenssignal fra hver droplet (32 brønde / time)

17. Precision fra 10% fortyndinger 1.1-fold fortyndingsrække af S. aureus Konstant humant gDNA

18. Copy Number Variation ddPCR individual wells ddPCR merged wells • DNA fra 7 cellelinier med kendt copy number variation • Resultaterne er normaliseret overfor en kopi af RNase P

19. BRAF V600E fortynding af DNA