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DNA 遗传标记

DNA 遗传标记. 特点：1.直接反映基因特征，非推测。 2.基因座位数量多，无论表达与否。 3.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力 强。 4.适合于陈旧的样品，检测能力强。 5.灵敏度高，有利于微量样品的检测。 6.易于检测手段的自动化、标准化，重复 性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方 法。. 第一部 DNA 基础. 一、 DNA 结构与特征 1. DNA 分子结构 线性大分子-基本单位为脱氧核苷酸

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DNA 遗传标记

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  1. DNA遗传标记 特点：1.直接反映基因特征，非推测。 2.基因座位数量多，无论表达与否。 3.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力 强。 4.适合于陈旧的样品，检测能力强。 5.灵敏度高，有利于微量样品的检测。 6.易于检测手段的自动化、标准化，重复 性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方 法。

  2. 第一部 DNA基础

  3. 一、DNA结构与特征 1.DNA分子结构 线性大分子-基本单位为脱氧核苷酸 组成----碱基、脱氧核糖、磷酸 差别----碱基：嘌呤碱—腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G） 嘧啶碱—胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T） 结构：碱基+脱氧核糖=脱氧核苷-+磷酸=脱氧核苷酸

  4. 2. DNA理化性质 1）DNA的变性 变性（denaturation）:在一定条件下，DNA双链间氢键断 裂，形成单链结构的过程。也称退火（annealing）。 条件：A：温度上升----Tm值(melting temperature) 50%DNA分子解链的温度。 与GC/TA比值有关。1%GC-0.4℃。 B：碱性升高--- 0.5N NaOH-完全解链。 2） DNA的复性 复性（renaturation）撤除变性条件后，变性的单链 DNA根据碱基互补的原则，恢复成DNA双链的过程。 条件：A：温度降低—过低易错配。过高不易复性。 B：高离子强度。 3） DNA分子杂交 杂交（hybridization）：来源不同的两条DNA单链根据 碱基互补的原则，形成双链杂种DNA的过程。

  5. 二、基因 1. 基因与基因组 基因（gene）：合成有功能的蛋白质多肽链 或RNA所需的全部核苷酸序列 基因组（genome）：一个生物体的所有基因。 核基因组：细胞核中23对染色体包含的所有基因 线粒体基因组：线粒体DNA中的所有基因 2. 基因结构 结构基因：能够编码产生蛋白质产物的基因。 外显子（exon）：编码序列。 内含子(intron)：非编码序列（间隔列）。 如β珠蛋白-1700碱基（bp），编码146个氨 基酸，3个外显子，2个内含子。

  6. 3. 基因突变 突变（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改变。 1）点突变（point mutation）：单碱基置换。 同义突变（same sense mutation）: 简并密码，无突变效应。 错义突变(missense mutation)：新密码子，氨基酸序列变化，产生突变效应。 无义突变(non- sense mutation)：变成终止密码，合成不完整多肽产生突变效应。 终止密码突变（terminator codon mutation)：合成过长的多肽，产生突变效应。 移码突变（frame-shift mutation)：DNA链中插入1个或几个单碱对，使突变处以下部位密码发生变化，使合成的氨基酸种类或序列变化，产生突变效应。 2）片段突变：DNA链中小片段单碱序列发生缺失、重复或 重排，产生突变效应。

  7. 单碱基突变(图中用黑点示意位置为突变点)

  8. 三、DNA多态性的分类 1）长度多态性：等位基因片段长度的个体差 别。由一特定序列，首尾相连串联 重复次数不同产生的个体差别。 可变数目串联重复（variable number of tandem repeat,VNTR） 短串联重复(short tandem repeat,STR) A：产生原因：DNA滑动与同源染色体 不等交换。

  9. B：差别： VNTR STR 重复序列组成 2-7 bp 7-数十bp 重复序列数目 2-10数个 10数个-数百个 鉴别能力 高 极高 优势扩增现象 不明显 极明显 检测灵敏度 极高 稍差 片段总长度 200-500 bp 数千以上bp C：STR的命名： 非编码区-D3S1358 D3 第三号染色体 S 单拷贝（single copy） 1358 VNTR序列的发现序号 编码区内含子-HumHPRTB 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因 （ hypoxanthine phosphoribosyl transferase）

  10. 1）序列多态性：DNA片段碱基排列顺序的个体差别。1）序列多态性：DNA片段碱基排列顺序的个体差别。 单核苷酸多态性 （single ucleotidepolymorphism,SNPs） 原因：碱基的置换、插入、缺失。 特点：多位于非编码区，选择压力。 数量多，1/1000 bp，300万 二态性，2个等位基因，多态性 程度较低。 孤立事件，人类遗传学意义大。

  11. 第二部分 DNA的制备

  12. 核心与关键 脑>肺>肌肉>肾 6pg/细胞 一、理想DNA样品的要求 1.纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。 2.完整性-DNA大分子。 3.DNA量。Μg/指纹图；ng/PCR；pg/PCR 二、经典DNA提取法 1.在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆， 溶解胞、核膜。 2.去垢剂与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。 3.有机溶剂去除蛋白，萃取DNA。 4.乙醇与盐类沉淀DNA。

  13. 三、试剂的使用原理 1.弱碱和螯合剂：Tris-HCl pH8.0，DNA分子稳定。 EDTA（乙二胺四乙酸）-抑制核酸酶。通过螯 合镁离子。 2.去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）：增加膜 通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶 与蛋白质变性。 蛋白酶K：酶解组蛋白。 3.有机溶剂：酚-变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白酶等。 PH6.0，需Tris-HCl pH8.0平衡。 氯仿-变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。 异戊醇-除酚，除泡沫。 4.乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。

  14. 四、基本步骤 1.样品处理-分离细胞，低渗盐水或细胞悬浮液。 10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰 RNA酶,0.5%SDS. 2.消化-TNE （15mmol/L Tris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl）4ml，10%SDS0.45 ml，10mg/ml蛋白 酶K（终浓度100μg/ml）混匀，50℃3h，45℃过夜。 3.DNA提取-等体积饱和酚-等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）-氯仿/异戊醇（24/1）。500r/min,10min. 4.沉淀DNA-1/10体积3mol/L NaAc，2倍无水乙醇-70%乙醇。室温挥干。 5.溶解DNA-适量TE（10mmol/L Tris- HClpH8.0,1mmol/LEDTA,长时间。

  15. 五、其他方法 1.Chelex-100提取DNA 基本成分：含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基 苯共聚物。 基本方法：沉淀细胞；5%试剂200μl；56℃0.5h以 上；100℃8min；剧烈震荡；离心上清。 注意： 离心彻底。 2.硅珠法提取DNA 基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性剂）与二氧化 硅（硅珠，核酸吸附剂）。 基本方法：血液（1-4μl）TES（100μl）SDS （20μl）煮沸5min；300μlGuSCN溶液 与20μl硅珠液保温15 min；离心；离心 加GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗； TES56℃10 min离心取上清。 3.直接煮沸法，100℃10min

  16. 六.注意事项 1.如消化不完全，可用TNE溶解后再重提。 2.消化时间宜长不宜短。 3.操作轻柔。 4.混匀要充分。 5.挥干不宜过度。

  17. 七.不同生物性检材的DNA制备 1.混合斑二步提取法（精液与阴道液） 原理： 精子细胞膜富含硫醇蛋白，包裹DNA 的鱼精蛋白富含半光氨酸，二硫键丰富，可 抵抗蛋白酶作用。二硫苏糖醇（DTT）可还 原二硫键，使蛋白酶发生作用。 方法: (1)分离细胞成分。 (2)常规消化。 (3)加10%SDS40μl，1mol/L DTT16μl ， 10μg/μl蛋白酶K4μl，37℃过夜。 (4)常规处理。

  18. 八.DNA定量 1.凝胶电泳半定量分析法 标准参照分析。 2.分光光度计分析 原理：核酸于260nm波长为吸收峰，1OD值 为50μg/μl双链核酸（40μg/μl单链核 酸），根据OD值可计算DNA含量。蛋白 于280nm波长为吸收峰，260/280比检测 核酸纯度。1.6-1.8 九.DNA纯化

  19. 第三部分 聚合酶链式反应技术

  20. 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction，PCR）在模板DNA和4种脱氧核苷酸存在的条件下，由一对特异性引物限定的靶DNA片段，经DNA聚合酶催化的体外合成过程。

  21. 一、PCR的基本过程 1.变性（denaturation）:在加热的条件下（94℃左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂，DNA双链变成单链。 2.退火（annealing）：在降温的条件下（55℃-62℃），引物与其互补的模板DNA结合形成杂交双链。 3.延伸（extension）：在合适的温度下（68℃-72℃），经DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸，由引物的3ˊ端为起始点，从5ˊ向3ˊ端延伸，合成新的与模板DNA 互补的DNA链。 每反应一个循环，靶DNA片段数量增加一倍，并以指数的量堆积，经30余次循环，产物量可达到2×105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板。

  22. 二、PCR反应的体系 标准体系为50-100μl，常用20μl。 DNA模板/DNA聚合酶/一对引物/4种脱氧核苷酸/缓冲液。 反应条件：95℃4-5min,94℃30s,55℃-62℃30s,72℃30-60s,30循环后72℃5-10min。

  23. 三、试剂的要求： 1.引物：人工合成的单链DNA。 A：长度15-30bp。Ln=2×(G+C)+(A+T)<38,延伸温度大。 B：内部的互补序列。 C：引物间的互补序列。 D：序列的随机。 E：识别序列的单拷贝。引物决定特异性。 F：浓度：02-1μmol/L。 G：应纯化低温保存。 2. DNA模板 A：量10ng左右。 B：纯，无污染。 3.DNA聚合酶 A：根据具体实验要求选择。 B：注意外切酶活性，5-3或3-5。 C：活性最适温度70-75℃，半衰期一般95℃40 min 92℃130 min D：镁离子依赖。

  24. 第六章 DNA多态性分型方法

  25. 一、长度多态性分型 扩增片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphisms,Amp-RLP）。主要指VNTR和STR

  26. 1.步骤 （1）PCR扩增，遗传标记特异性由特异性引物决定。 （2）电泳分离PCR产物 A：凝胶：聚丙烯酰氨凝（polyacrylamidegel,PAG）， 成分：丙烯酰氨与甲叉丙烯酰氨 凝胶浓度（T）：6-8%，与分析的片段大小有关。 交联度（C）：3%，甲叉/丙烯酰氨与甲叉 B:载样缓冲液：甘油（蔗糖）密度重力，防扩散。 泳速指示剂：溴酚蓝（5%，65bp） 二甲苯青（5%，260bp） C：电压：100-200V

  27. （3）谱带显示： A：溴乙啶染色：ethidium bromide,EB,嵌合与 DNA双链间，紫外线激发红色荧光。 注意：强致变剂。可加凝胶中或后染色。 B：银染色：AgNO3，Ag+可与DNA稳定结合， 甲醛还原Ag+颗粒，显黑褐色。比溴乙啶敏感度高。 C：荧光显色: (P78)染料标记在引物5ˊ端，激光激发。 （4）基因型判定：根据等位基因分型标准物（allele ladder）或片段长度标准物(molecular marker)同步 电泳比对判型。 等位基因命名根据重复序列的重复次数。 注意事项：出现3条谱带或3个峰时，污染、混合样品、变异。

  28. 2.STR基因座的选择： A：重复序列为4个碱基。 B：等位基因数量在10个左右。 C：基因座距离足够远。 D：引物识别序列尽可能单拷贝。 E：PCR产物在100bp-300bp之间。 3.多基因座复合扩增检测

  29. 二、序列多态性分型 （一）限制性片段长度多态性分析法 restriction fragment length polymorphisms,RFLPs 因DNA核苷酸序列的变异，使DNA限制性内切酶识别部位产生、消失或移位，致使酶切片段长度和/或数量发生变化而呈现的DNA多态性。

  30. 1. 限制性片段长度多态性的DNA基础 （1）识别部位的点突变：碱基的替换、修 饰（甲基化）或插入与缺失。 （2）识别部位间的片段插入与缺失。 （3）识别部位间的重复序列数目的变化。

  31. 2. DNA限制性内切酶 restriction endonuclease 能够识别特定的DNA序列，与DNA分子结合后在特定部位将DNA双链切断的核酸水解酶。 （1）生物学功能：水解核酸的磷酸二酯键。 （2）命名：根据微生物的种（第一个字母大 写）、属（前二个字母小写）、变种第一个 字母大写）、发现分离的顺序（罗马数字）。 （3）分类： A：Ⅰ型：远离识别部位随即切割，非特异。 B：Ⅱ型：在识别部位内部切割，特异。 C：Ⅲ型：在识别部位后定点切割，特异。 单位：1U：在标准条件下，1h完全水解1μgλ噬菌体的酶量。

  32. Ⅱ型DNA限制性内切酶： A：识别核酸序列数目4-6个。 B：识别序列为回纹序列。 C：切割后产生的末端分为粘行末端与平 末端。 例：PstⅠ 5ˊ-C↓TGCAG-3ˊ 3ˊ-GACGT↑C-5ˊ HaeⅢ 5ˊ-GG↓CC-3ˊ 3ˊ-CC↑GG-5ˊ

  33. 3.分型法： 酶+缓冲液+样品----一定的温度----电泳检测。 4.注意事项： A：星号活力。 B：消化时间宜长不宜段。 C：阳性可肯定序列，阴性序列不定。

  34. （二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交分析法（二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交分析法 allele specific oligonucleotide,ASO 根据硷基互补的原则,制备识别特定寡核苷酸序列的单链DNA探针,并标记示踪物,在高强度条件下与变性DNA样品杂交,检测示踪物,阳性者为检出相应的等位基因。

  35. 1.相关概念： A：杂交：两条异源寡核苷酸单链按照硷基互补的原则复性为双链的过程。 B：探针：标记有示踪物，能够识别靶核苷酸序列并与之退火杂交的具有以知序列的寡核苷酸单链。 2. 探针的条件: A:长度为20bp左右。 B：具备高度特异性。 C：容易标记示踪物。 D：在杂交过程中本身性质稳定。

  36. 3.对示踪物的要求 A:高灵敏度。 B:不影响探针的特异性。 C: 不影响探针的杂交特性。 D：不改变本身的特性。 E：检测方法特异。 F：安全可靠无公害。 G：检测方法简单，重复性好。

  37. 4. 示踪物的种类 A：放射性同位素--灵敏度高，有放射性污染。 B：非放射性同位素：半抗原 生物素 荧光物质 酶—常见辣根过氧花物酶 碱性磷酸酶 5.检测方法—斑点印迹杂交dot blot hybridization 反向斑点杂交reverse dot blot

  38. 6.基本操作过程 A：固相滤膜印迹-打点、Southern转移、 真空转移、电转移。常用尼龙膜。 B：DNA变性—碱变性、紫外线照射、真 空烘烤。 C：预杂交—封闭 D：杂交： 高强度杂交-温度高，离子强度低。 特异不利于复性。 低强度杂交-温度低，离子强度高。 利于复性不特异。 E：漂洗 F：示踪物显示。

  39. 三、等位基因特异性PCR（序列特异性引物PCR） allele specific PCR，ASPCR（sequence specific primers,SSP-PCR） 基本原理：根据待测等位基因的碱基差异设计3条特异性引物，其中2条引物为上游（或下游）引物，其3端第1个碱基（或第2、3个碱基）分别与等位基因特异性碱基互补，作为等位基因特异性引物；1条下游（或上游）引物作为共通引物。分为两个体系同时PCR扩增，对比电泳，依据PCR产物的有无判定等位基因的型别，有PCR产物者为阳性，证实该等位基因存在。

  40. 方法：1. 设计3条引物，2条等位基因特异性引物，其5端长度有差异（5端差4-6bp），与共通引物引物在1个体系中同时PCR扩增，电泳后，依据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 2. 同一片段多等位基因同时检测：依据片段上等位基因数目，设计两组多条等位基因特异性引物，分别与共通引物在1个体系中同时PCR扩增，对比电泳后，依据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 3. 不同染色体上多等位基因同时检测：设计两组多条等位基因特异性引物及相应的共通引物，并在引物的5端人工设计10bp左右碱基序列，PCR产物对比电泳后，依据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 技术关键点：1.引物特异性碱基设计的位置。 2.多位点复合扩增的PCR反应条件。

  41. 四、随机引物PCR random primer PCR 特点：1.PCR反应仅1条引物。 2.引物碱基序列随机。 3.引物长度10bp左右。 4.复性温度低。 5. 扩增片段多,但符合孟德尔遗 传规律。 6.可多引物复合扩增,增加信息含 量。 7.重复性欠佳。

  42. 五、PCR单链构型多态性分析PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP 1、基本原理：PCR产物热变性后形成单链 DNA，在非变性凝胶中，因DNA 片段碱基排列顺序的不同，单链 DNA形成不同的（空间构型，导 致电泳迁移率的差别而呈现多态 性，根据谱带的位置判定型别。

  43. 2、特点： A：样品需要充分变性（加样品缓冲液，沸水浴 10min），并保持至电泳前。 B：电泳凝胶为非变性凝胶。 C：泳动过程中温度保持恒定。 D：分辨率高，可检测出单一碱基变异，检出率90% 以上。 E：重复性稍差，多用于筛选实验。 F：不能确定突变碱基的种类与位置。 G：样品片段应短于500bp。 H：电泳谱型可能出现四条片段（1处变异）：同源双 链；异源双链；两种碱基排列顺序不同的单链DNA。

  44. 六、扩增片段长度多态性检测法 amplified fragment length polymorphism,AMP-PCR 1、基本原理：应用一对特异性引物，选择VNTR或STR基因座进行PCR扩增，由于基因座不同等位基因串联重复次数的差异，导致PCR产物DNA片段数目与长度不同，经电泳后，依据谱带的数目和位置判定型别。

  45. 2、特点： A：操作简单，重复性好。 B：泳动中根据等位基因标准品认定型别。 C：可检测的基因座数量多。 D：可将多基因座复合扩增。 [复合扩增要求]： A：引物间无互补序列。 B：基因座不在同一染色体上，或距离足够远。 C：不同基因座PCR产物片段长度分布不交叉。 D：不同基因座PCR扩增条件相近。 E：片段长度差异不宜过大。（优势扩增） F：变性胶检测效果好。

  46. 3、用于检测的STR基因座选择条件： A：重复序列碱基数目3-5之间，易于分辨。 B：等位基因数目适中，10个左右。 C：各等位基因频率分布均匀。 D：杂合度高。 E：扩增片段长度小于300 bp。 F：突变率低。 G：避免检测连锁的基因座.（影响计算结果）

  47. 七、小卫星重复单位变异分型 ministatellite variant repeat mapping,MVR-PCR 1、基本原理：部分VNTR基因座的重复序列存在碱基变异，据此设计相应的序列特异性引物，与共通引物分别进行PCR扩增，分泳道对比电泳检测PCR产物，根据谱带的有无与位置编码后判定型别。 2、特点：A：DNA片段数目多，类似DNA指纹图。 B：分辨率高，个人识别能力高。 C：编码分型，不需标准对照。 D：普通检测手段不能够反映全基因状况。 E：反映了基因座长度多态性与已知序列多态性的性 质。

  48. 八、DNA序列分析（双脱氧核苷酸末端终止法） 1、基本原理：在常规PCR反应体系中加入四种2，3-双脱氧 单核苷酸，由1条引物进行PCR反应，在正常的模DNA 复制同时，当有2，3-双脱氧单核苷酸结合到产物3端 后，下一个单核苷酸不能够与之形成磷酸二酯键，使 DNA 片段延伸终止于该2，3-双脱氧单核苷酸处，根据 不同长度含有2，3-双脱氧单核苷酸片段的检测结果判 定PCR产物的单核苷酸序列。 2、特点： A：完全忠实地反映靶片段核苷酸排列顺序。 B：测序反应为1条引物（浓度低于常规PCR反应）。 C：根据方法学，一次反应可测200-500 bp。 D：产物分析分别有手工与机器自动化方法。

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