Seente molekulaargeneetika

1. Seente molekulaargeneetika Heidi Tamm

2. (kott)seened mudelorganismidena • Saccharomyces cerevisiae • Aspergillus nidulans • Schizosaccharomyces pombe • Neurospora crassa

3. Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganism • Eukarüoot • Lihtne kasvatada • Väike genoom kergesti manipuleeritav • Kasvab kiiresti • Mutantide isoleerimise lihtsus • Hästidefineeritud geneetiline süsteem • Rekombinatsioon kõrge sagedusega

4. Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganism • Mitmekülgne DNA transformatsiooni süsteem • Nii haploidne kui ka diploidne faas stabiilne • Mittepatogeenne • Metaboolsed ja regulatoorsed mehhanismid kõrgelt konserveerunud • Inimeste haigustega seotud geenide ortoloogid • ...

5. Pärm: milliseid protsesse uuritakse? • Geeniregulatsioon • raku koostisosade biosüntees • mRNA translatsioon • valkude post-translatsiooniline modifitseerimine • valkude sekreteerimine • mitokondri biogenees • võõrgeenide ekspressioon

6. Pärm: mida uuritakse? • Rakutsükli regulatsioon • Signaaliülekande mehhanismid • Kromosoomi struktuur • DNA replikatsioon • Genoomika

7. Neurospora ja Aspergillus Haploidne vegetatiivne faas ja haploidsed koniidid - seeneniidistiku fenotüübi järgi saame teha järeldused genotüübi kohta

8. Neurospora

9. Aspergillus

10. Neurospora ja Aspergillus • Iga eoskott sisaldab 8 eost • peale meioosi toimub mitoos • 2n tuuma iga üksik DNA ahel läheb ühe eose tuuma • võimaldab algse DNA detailset analüüsi • isegi heterodupleksi erinevused tulevad välja (osaline erinevus kaksikheeliksi ahelates)

11. Seente transformatsioon • Katsetatud paljudel seentel • Head protokollid olemas üksikute jaoks: • Saccharomyces • Aspergillus • Neurospora • Ustilago

12. Mida on vaja transformatsiooni läbiviimiseks? • Vektor, milles meid huvitaval geenil on sobiv promootor ja terminaator • Seenerakud peavad olema kompetentsed • Selektsioonisüsteem • (Protoplastidest tuleb regenereerida mütseel)

13. Võimalused transformatsiooniks • Protoplast • Terve raku töötlemine Ca2+ ja Li+ ioonidega • Elektroporatsioon • Geenipüss (gene gun, particle bombardment)

14. YAC

15. S. cerevisiae genoom sekveneeriti 1996 • Goffeau et al. 1996. Science 274: 546 • esimene täielikult sekveneeritud eukarüootne genoom

16. Ascomycota Saccharomyces cerevisiae strain S288C 12 Saccharomyces cerevisiae strain RM11-1a 12 Saccharomyces pastorianus 26 Candida guilliermondii 12 Candida lusitaniae 16 Candida tropicalis 30 Candida glabrata 12 Ashbya gossypii 9 Debaryomyces hansenii 10 Kluyveromyces lactis 11 Pichia stipitis 15 Yarrowia lipolytica 21 Schizosaccharomyces pombe 14 Aspergillus nidulans 31 Aspergillus fumigatus 32 Aspergillus oryzae 37 Aspergillus niger 37 Chaetomium globosum 36 Coccidioides immitis 29 Nectria haematococca 52 Fusarium graminearum 40 Fusarium verticillioides 46 Magnaporthe grisea 40 Neurospora crassa 43 Stagonospora nodorum 37 Trichoderma reesei 33 Epichloë festucae 35 Basidiomycota Coprinus cinereus 38 Cryptococcus neoformans20 Ustilago maydis 20 Phanerochaete chrysosporium 35 Zygomycota Rhizopus oryzae 40 Microsporidia Encephalitozoon cuniculi 2.5 Dictyosteliomycota (Protozoa) Dictyostelium discoideum 34 Oomycota (Chromista) Phytophthora ramorum 65 Phytophthora sojae 95 Sekveneeritud seened Mbp

17. http://www.genomesonline.org Genomes online database (GOLD)

18. S. cerevisiae genoom • 12.1 Mb • ~200 korda väiksem inimese genoomist • ~ 4 korda suurem E. coli genoomist • 16 kromosoomi • Kromosoomide suurused 250-2500 kb • ~ 6000 ORF-i • Valke kodeerivad alad moodustavad 70% genoomist

19. S. cerevisiae genoom • 3.8% ORF-e sisaldab introneid • Järjestikku ~ 120 rRNA geenide komplekti kordust (XII kromosoomis) • 275 tRNA geeni

23. S. cerevisiae valke kodeerivad geenid

24. S. cerevisiae geeniproduktide jaotus vastavalt bioloogilistele protsessidele

25. S. cerevisiae kromosomaalsete geenide nomenklatuur Gene symbolDefinition • ARG+ All wild-type alleles controlling arginine requirement • ARG2 A locus or dominant allele • arg2 A locus or recessive allele confering an arginine requirement • arg2– Any arg2 allele confering an arginine requirement • ARG2+ The wild-type allele • arg2-9 A specific allele or mutation • Arg+ A strain not requiring arginine • Arg– A strain requiring arginine • Arg2p The protein encoded by ARG2

26. S. cerevisiae mitokonder • Mitokondris leiab aset suur hulk biokeemilisi reaktsioone • Oksüdatiivse fosforüleerimise teel produtseeritakse ATP ja NAD+ • Pärmid on fakultatiivsed anaeroobid, mis tähendab, et nad saavad hakkama ka ilma molekulaarse hapnikuta => võivad elada ilma funktsionaalse hingamisahelata

27. Pärmi elu ilma hingamata • Eeldab sobivat süsinikuallikat (suhkrud) • ATP süntees glükolüüsi ja kääritamise käigus • Rakud kasvavad aeglaselt, kolooniad on väikesed • Kääritataval söötmel kasvab ka siis, kui mtDNA on mutantne või puudub üldse

28. Pärmi mitokondriaalne genoom • Suurus ~ 80 kb (inimesel 16.5 kb) • Lineaarne! • Ühes haploidses pärmirakus ~ 50 mtDNA koopiat • Kodeerib hingamisahela ensüüme • Ülejäänud valgud kodeerib tuuma genoom • Tsütoplasmaatiline pärilikkus

29. Pärmi mitokondriaalne genoom ehk ρ faktor • Metsiktüüpi pärmirakud (‘grande’), mis hingavad normaalselt ja moodustavad suuri kolooniaid, on ρ+ • ‘Petite’ mutandid ei ole võimelised hingama ja nad moodustavad fermenteeritaval söötmel väikesi kolooniaid • ρ0 rakkudel puudub mtDNA üldse • ρ- rakkudel esineb mtDNA, mis on moodustunud wt mitokondriaalse genoomi üksikutest fragmentidest, mis esinevad paljude kordustena

30. ‘petite’ - mutandid • Saab eristada, ristates neid wt rakkudega • ρ0 rakud annavad wt (‘grande’) järglased • keskmiselt supressiivsete ρ- rakkude järglased on pooled ‘grande’ ja pooled ‘petite’ • hüpersupressiivsete ρ- (HS) rakkude järglased on peaaegu kõik ‘petite’

31. ρ- mtDNA • Sisaldab wt mtDNA üksikuid fragmente, mis esinevad paljude kordustena • HS ρ- mutantidel on selliseks fragmendiks arvatavasti replikatsiooni alguskoht (ori)

32. Schizosaccharomyces pombe • Genoomi suurus 13.8 Mb • 3 kromosoomi • Pooldub, mitte ei pungu • Kasutatakse raku kasvamise ja jagunemise uurimiseks

33. Suguline paljunemine • Et saada maksimaalset kasu, peaksid ühinevate rakkude tuumad olema nii erinevad kui võimalik • Tsütoplasmad peaksid olema nii sarnased kui võimalik (et vältida geneetilist saastust) • Vegetatiivne vs. seksuaalne kokkusobivus

34. Vegetatiivne kokkusobivus • Heterokaarüonid tekivad vaid samasse vegetatiivse kokkusobivuse gruppi kuuluvate hüüfide vahel • Kui hüüfid ei ole kokkusobivad, siis vahetult kontakteeruvad rakud surevad

35. Vegetatiivne kokkusobivus/sobimatus • Liitumise kokkusobimatus (fusion incompatibility) - kokkusobivussüsteem määrab ära rakkude võime liituda. (hallitusseentel) • Liitumisejärgne kokkusobimatus (post-fusion…) – määrab ära, kas koos tsütoplasmaga saavad migreeruda ka tuumad jm. organellid

36. Ristumissüsteemid (suguline sobivus) • On määratud tuuma geenide poolt, mis takistavad kahe geneetiliselt identse mütseeli ristumist • Heterotallism – süsteem, kus on takistatud ristumine kahe identse gameedi vahel • Homotallism – kui miski ei takista identsete gameetide ristumist

37. Ristumissüsteemid: unifaktoriaalne • Kui on ainult kaks ristumistüüpi: tüüp sõltub sellest, milline kahest alleelist on ristumistüübi lookuses. Kuna on vaid üks lookus, millest tüüp sõltub => unifaktoriaalne kokkusobimatus. Edukalt ristuvad vaid rakud, millel on ristumistüübi lookuses erinevad alleelid. N. crassa, S. cerevisiae, Puccinia graminis

38. Ristumissüsteemid: bifaktoriaalne • Kaks omaette ristumistüübi lookust (A ja B). • Bifaktoriaalne • Edukaks ristumiseks on vaja erinevaid alleele mõlemas lookuses • Populatsioonis palju erinevaid alleele kummagi lookuse kohta • Paljudel kandseentel: Coprinus cinereus, Schizophyllum commune

39. Coprinus cinereus

40. Schizophyllum commune

41. S. cerevisiae ristumistüübi faktorid • 2 ristumistüüpi: a ja α • Ristumistüüp määratud: • peptiidhormoonide (feromonide) poolt (α- ja a-faktorid) • feromonispetsiifiliste retseptorite poolt

42. Kuidas ristumistüübi faktorid toimivad? • Feromon seostub vastastüüpi raku pinnal oleva retseptoriga. Selle sündmuse tagajärjed: • rakus algab aglutiniini tootmine, nii kleepuvad rakud kokku • mõlema raku kasv peatub G1 faasis • muutub rakuseina struktuur ja raku kuju

43. a-tüüpi rakkudes produtseeritakse: • a-feromoni • α-feromoni retseptorit • ja vastupidi • a ja α feromonide ja nende retseptorite geenid on olemas mõlema ristumistüübi genoomides

44. MAT lookus • Lookuses on 2 geeni (a1 ja a2 või α1 ja α2) • MATa1 represseerib a-feromoni retseptori ja α-feromoni sünteesi • MATa2 funktsioon teadmata • MATα1 aktiveerib a-feromoni retseptori ja α-feromoni sünteesi • MATα2 represseerib α-feromoni retseptori ja a-feromoni sünteesi

45. Kui tuumad on ühinenud: • Diploidid on alati MAT lookuse suhtes heterosügootsed • a1 ja α2 valgud moodustavad heterodimeeri, mis aktiveerib meioosi ja sporulatsiooni ja represseerib haploidsed funktsioonid

46. Et asi oleks tõeliselt segane... • Pärmi haploidsed rakud saavad oma ristumistüüpi muuta • Kontrollib geen HO (endonukleaas) • Dominantse alleeli korral toimub see peale igat raku jagunemist HML MAT HMR

47. N. crassa – tetraadide analüüs • Eoskotid kui korrastatud tetraadid - alleelide kombinatsioon eostes vastab meioosi I ja II jagunemisele • meioos I - kahe (homoloogilise) kromosoomi lahknemine • meioos II - kahe tütarkromatiidi lahknemine

48. Tetraadide analüüs • Saab jälgida rekombinatsiooni toimumist ja kindlaks teha aheldatuse gruppe • Kottseened sobivad geenide meiootiliseks kaardistamiseks • Pärmil on eoskotis 4 eost, mis on ühe meioosi tulemus • Mitme alleeliga geenide aheldus • Lookuse asukoht tsentromeeri suhtes

49. Tetraadide analüüs tänapäeval • Et kindlaks teha mutatsiooni, mis vastab konkreetse lookuse muutmisele • Et konstrueerida uusi tüvesid • Et kindlaks teha geenide interaktsioone

50. Erinevad tetraaditüübid. Ristati AB × ab Eri tüüpide osakaal näitab, kas A ja B on aheldunud