Susceptibiliteitsbepaling
Download
1 / 20

Inleiding - PowerPoint PPT Presentation


  • 151 Views
  • Uploaded on

Susceptibiliteitsbepaling van planktonische en sessiele Burkholderia cepacia complex cellen Katrien De Visschere. Inleiding. Burkholderia cepacia complex: 17 nauw verwante species Gram-negatieve bacteriën Kunnen ernstige infecties veroorzaken bij mucoviscidosepatiënten

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Inleiding' - phil


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

Susceptibiliteitsbepaling van planktonische en sessieleBurkholderiacepacia complex cellenKatrien De Visschere


Inleiding
Inleiding

  • Burkholderia cepacia complex:

    • 17 nauw verwante species

    • Gram-negatieve bacteriën

    • Kunnen ernstige infecties veroorzaken bij mucoviscidosepatiënten

    • Behandeling moeilijk door grote resistentie

    • ≠ stammen vormen goed biofilms→ verhoogde resistentie


Inleiding1
Inleiding

  • Mucoviscidose

    • Autosomaal recessieve aandoening

    • Ongeneeslijk

    • Secreties van kliercellen zijn minder vloeibaar→ o.a. problemen met luchtwegen en spijsvertering

    • Infectie met B. cepacia complex bacteriën:→ “cepacia syndroom”: dodelijk→ geleidelijk achteruitgang in longfunctie


Inleiding2
Inleiding

  • Biofilms

    • Microbiële gemeenschap van sessiele cellen

    • Vastgehecht op een substraat, een oppervlak of aan elkaar

    • Ingebed in een extracellulaire matrix

    • Sessiele cellen vertonen in het algemeen een grotere resistentie tegen antimicrobiële agentia dan planktonische cellen


Onderzoek
Onderzoek

  • Wat?

    • Gevoeligheid van planktonische cellen en sessiele cellen (biofilms) van 33 ≠Burkholderiacepacia complex stammen t.o.v. 6 ≠ antibiotica bepalen → ceftazidime, ciprofloxacine, meropenem, minocycline, tobramycine, trimethoprim-sulfamethoxazole (1-19)

    • Experimenten op “jonge” en “oude” culturen

      • Planktonische cellen

        • “Jonge” culturen: minimaal inhiberende concentratie (MIC)

        • “Oude” culturen: afdoding stationaire fase cultuur

      • Sessiele cellen

        • “Jonge” culturen: minimaal biofilminhiberende concentratie (MBIC)

        • “Oude” culturen: afdodingmaturebiofilm


Onderzoek1
Onderzoek

  • Waarom?

    • Vergelijken groei-inhibitie bij “jonge” planktonische cellen en biofilms door antibiotica

    • Vergelijken afdoding van planktonische cellen in de stationaire fase en mature biofilms door antibiotica


Methoden
Methoden

  • “Jonge” planktonische cellen:

    • Verse reincultuur → kiemsuspensie (OD: 0,05) in MH 1x→ 50x verdunnen

    • Kuipjes van antibiotica-microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: plat) vullen met MH 1x en verdunde kiemsuspensie

    • 20u incubatie (37°C)

    • Absorptie in elk kuipje meten met VICTOR2TM

    • Bepaling minimaal inhiberende concentratie (MIC)

    • Kuipjes zonder groei → 100µL uitplaten (strijkplaatmethode)

    • Na 48u incubatie (37°C): groei nagaan

    • Bepaling minimaal bactericide concentratie (MBC)


Methoden1
Methoden

  • “Jonge” biofilms:

    • Verse reincultuur → startsuspensie in MH 1x

    • Nacht incubatie in warmwaterbad (37°C)

    • Startsuspensie → werksuspensie (OD: 0,05)

    • Kuipjes van microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: rond) vullen met MH 1x en werksuspensie (100µL)

    • 4u incubatie (37°C)

    • 3x spoelen met fysiologisch water

    • Kuipjes vullen met 100µL MH 2x

    • Antibiotica toevoegen (100µL)


Methoden2
Methoden

  • “Jonge” biofilms:

    • 20u incubatie (37°C)

    • Spoelen met fysiologisch water

    • CellTiterBlue toevoegen (detectie levende cellen)

    • 1u incubatie (37°C)

    • Fluorescentie meten met VICTOR2TM

    • Bepalen minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC)


Methoden3
Methoden

  • Mature biofilms:

    • Verse reincultuur → kiemsuspensie in MH 1x

    • Nacht incubatie in warmwaterbad (37°C)

    • Kiemsuspensie → startsuspensie (OD: 0,05)

    • Siliconeschijfjes in microtiterplaat (24 kuipjes) brengen

    • Kuipjes vullen met MH 1x en startsuspensie

    • 4u incubatie (37°C)

    • 3x spoelen met fysiologisch water

    • Kuipjes vullen met MH 1x

    • 20u incubatie (37°C)

    • 3x spoelen met fysiologisch water


Methoden4
Methoden

  • Mature biofilms:

    • Overbrengen in antibiotica-microtiterplaat→concentraties antibiotica: 10 x MIC, tobramycine: 4 x MIC

    • 20u incubatie (37°C)

    • 3 x wassen met fysiologisch water

    • Schijfjes overbrengen in falconbuisjes

    • Buisjes 3 x vortexen en soniceren (cellen losmaken)

    • Kiemsuspensie wordt 7 maal 1:10 verdund

    • 1mL per verdunning uitplaten (plaatgietmethode)

    • Kolonies tellen na 48u incubatie

    • Bepalen reducties in log(KVE)/schijfje


Resultaten mic
Resultaten: MIC

  • MIC vs. de klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatiënten (KHCS)


Resultaten mbc
Resultaten: MBC

  • Hoe verhoudt de MBC zich tot de MIC?

  • Grote spreiding MBC t.o.v. MIC

    → uitzondering: tobramycine (kleine spreiding)


Mbic vergeleken met mic
MBIC vergeleken met MIC

  • Relatie MBIC vs. MIC:

    • De MBICs zijn vergelijkbaar met de MICs voor het grootste deel van de stammen


Reductie in aantal cellen bij mature biofilms
Reductie in aantal cellen bij maturebiofilms

  • De onderzochte antibiotica veroorzaken bij alle stammen reductie

  • Mate van reductie: vertoont een grote variatie

  • Tobramycine is het meest werkzame antibioticum → met een paar uitzonderingen

  • Mate van biofilmvorming ↑, cellen die overblijven na behandeling met antibiotica↑

B. pyrrocinia LMG 14191

B. multivorans

LMG 13010

9,0

9,0

8,0

8,0

7,0

7,0

6,0

6,0

5,0

5,0

aantal cellen

(log(KVE)/schijfje)

aantal cellen

(log(KVE)/schijfje)

4,0

4,0

3,0

3,0

2,0

2,0

1,0

1,0

0,0

0,0

TMP-SMX

TMP-SMX

minocycline

minocycline

ceftazidime

ceftazidime

tobramycine

meropenem

meropenem

tobramycine

groeicontrole

groeicontrole

ciprofloxacine

ciprofloxacine


Conclusie
Conclusie

  • “Jonge culturen”

    • MIC: vergelijking met klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatiënten:  voor veel antibiotica is deze concentratie onvoldoende om groei-inhibitie te veroorzaken

    • MBC: variabel t.o.v. MIC (uitzondering: tobramycine)

    • MBIC: vergelijkbaar met MIC bijna alle MBICs liggen binnen de range [1/2 – 2] x MIC


Conclusie1
Conclusie

  • “Oude” culturen

    • Reductie in aantal cellen bij maturebiofilms:→ vertoont een grote variatie→ tobramycine is het meest werkzame antibioticum→ mate van biofilmvorming ↑, cellen die overblijven na behandeling met antibiotica↑


Toekomstperspectieven
Toekomstperspectieven

  • Experimenten op planktonische cellen in een stationaire fasecultuur moeten nog uitgevoerd worden:

    • Antibioticaconcentraties: 10 x MIC, behalve tobramycine: 4 x MIC


  • Met dank aan:

    • Prof. Nelis en Prof. Coenye

    • Apr. E. Peeters

    • Apr. B. Quartier



ad