Gliederung Nicht-invasive fetale RHD-Genotypisierung

1. Nicht-invasive pränatale RHD-BestimmungRHD-Genotypisierungzellfreier fetaler DNA 32. Informationsgespräch der Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

2. GliederungNicht-invasive fetale RHD-Genotypisierung 1 Hintergrund Prävention der Anti-D Bildung in der Schwangerschaft, Management von Antikörperträgerinnen in der Schwangerschaft Standard-Prozedere und fetale Genotypisierung im Vergleich Grundlagen der nicht-invasiven fetalen Gen-Diagnostik Zuverlässigkeit der Methode: Sensitivität und Spezifität 2 3 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

3. Nutzen fetaler RHD-BestimmungWann interessiert der kindliche RhD-Faktor? 1 Bei RhD-negativen Schwangeren: Prävention der Anti-D-Immunisierung Kein Immunisierungsrisiko bei RHD-negativen Feten Bei Antikörperträgerinnen: Nachweis des fetalen RHD-Genotyps HDFN-Risiko nur bei RHD-positiven Feten Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

4. Prävention der Anti-D-ImmunisierungStandards bei Schwangerschaften RhD-negativer Frauen1 1 - 28. SSW: Anti-D Immunglobulin - Bei RhD-positiven Neugeborenen: Anti-D Immunglobulin < 72 h p. partum 1 KAV-Richtlinien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

5. Anti-D-immunisierte SchwangereVoraussage für die Entwicklung einer HDFN 1 nicht invasive Diagnostik (Mutter): Anti-D-Titerbestimmung Ultraschall fetales RHD-Screening (RHD-NIPD) Invasive fetale Diagnostik: Diagnostik beim Kindesvater (?) Amniozentese RhD und Choriozentese RHD-Zygotiebestimmung Cordozentese (PCR) Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

6. Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung 1 Prof. J. Deutinger Universitätsklinik für Frauenheilkunde Medizinische Universität Wien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

7. Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung 1 Prof. J. Deutinger Universitätsklinik für Frauenheilkunde Medizinische Universität Wien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

8. Hydrops fetalis, 11. – 14. SSW 1 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

9. Doppler Ultraschalldiagnostik • A. cerebri media flow (MCA-PSV) Flow velocity waveform in the fetal middle cerebral artery in a severely anemic fetus at 22 weeks (left) and in a normal fetus (right). In fetal anemia, blood velocity is increased Bei einer schweren fetalen Anämie (Hb <6g/dl) ist die Flussgeschwindigkeit in der A. cerebri media signifikant erhöht. • Scheier M, Prediction of severe fetal anemia in red blood cell alloimmunization after previous intrauterine transfusions. Am J Obstet Gynecol. 2006 Dec;195(6):1550-6. Epub 2006 Jun 21 • Collins CY, Evaluating suspected fetal anemia with Doppler ultrasound. J Reprod Med. 2005 Jun;50(6):379-82

10. Anti-D-immunisierte SchwangereVoraussage für die Entwicklung einer HDFN 1 Nicht-invasive Diagnostik (Mutter): Anti-D-Titerbestimmung Ultraschall fetales RHD-Screening (RHD-NIPD) Invasive fetale Diagnostik:Diagnostik beim Kindesvater(?) Amniozentese RhD und ggf. Choriozentese RHD-Zygotiebestimmung Cordozentese (PCR)

11. Nutzen fetaler RHD-Bestimmung(Wann)ist die Genotypisierung sinnvoll? Prävention der Anti-D-Immunisierung bei Schwangerschaft RhD-negativer Frauen Bei Antikörperträgerinnen: Nachweis des fetalen RHD-Genotyps 2 Vermeidung von: passiver Immunprophylaxe (humanes Plasmapräparat) Unabhängigkeit von der Verfügbar-keit von humanem Anti-D Kosteneffizienz? Frühzeitige Klarheit Vermeidung von: invasiver Diagnostik und assoziierter Risiken

12. Entwicklung der RHD-NIPDInternationale Arbeitsgruppen SAFE NoE - Gruppe Special Non-Invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation Network of Excellence Sixth EC Framework Program Gemeinsame Protokolle Multizentrische Evaluierung Standardisierung der Prozesse 2

13. RHD negativ RHD positiv (heterozygot) RHD positiv (homozygot) Grundlage der GenotypisierungRHD- und RHCE-Gen 3 Daniels G. Human Blood Groups

14. Fetale Genotypisierung aus maternalem PlasmaLo et al. weisen DNA männlicher Feten in maternalem Plasma nach LO, Y.M.D.et al. 1997. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.Lancet 350: 485–487. FINDINGS: Fetus-derived Y sequences were detected in 24 (80%) of the 30 maternal plasma samples, [...] None of the 13 women bearing female fetuses, and none of the ten non-pregnant control women, had positive results for plasma, serum or nucleated blood cells. INTERPRETATION: Our finding of circulating fetal DNA in maternal plasma may have implications for non-invasive prenatal diagnosis, and for improving our understanding of the fetomaternal relationship. 3 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

15. Zellfreie fetale DNASynzytiothrophoblast als Ursprung der fetalen DNA 3 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Kumpel et al. Transfusion 2008

16. Anteil fetaler DNA an der zellfreien mütterlichen DNA Die cffDNA-Menge ist abhängigvomGestationsalter des FetenDie DNA-Menge liegt zum Zeitpunkt der Untersuchungteilweise nahe demstochastischen Bereich der rqPCR.DNA-Qualität: die cffDNA ist stark fragmentiert 3 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

17. Konzentration der cffDNAKonzentrationsunterschiede bei gleichem Gestationsalter 3 C. Ellen van der Schoot Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

18. Studien zur RHD-NIPDReview 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

19. Studien zur RHD NIPDErgebnisse von Sanquin, NL 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

20. Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNABeispiele Y-chromosomale Marker Lo et al. 1998 SYR Chin and Lo 2003 SYR Rijnders et al. 2004 SYR Avent and Chitty 2006 SYR Genetische Polymorphismen Lee et al. 2002 HLA-DQ Legler et al. 2002 RHCE, C, E, c Van der Schoot et al. 2003 insertion/deletion Brojer et al. 2005 insertion/deletion Epigenetik Chan et al. 2006 RAASF1A 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

21. Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNASensitivität der Methoden Zuverlässigkeit der Methode ist abhängig von: - geeignete Amplifikationskontrollen für fetale DNA - geeignetes Entscheidungsschema Das Verfahren muss ausreichend sensitiv sein, jeden RHD-positiven Feten richtig zu typisieren. Falls zu wenig fetale DNA vorhanden ist, muss das erkannt werden. 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

22. Amplifikation fetaler DNASpezifität der Methoden Falsch positive Ergebnisse sind nicht kritisch: Bei vermeintlich RHD-positiven Feten würde der Schwangeren eine nicht indizierte Anti-D-Prophylaxe verabreicht werden. 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

23. Fetale DNA-MethylierungUniversaler fetaler DNA-Marker für nicht-invasive Diagnostik K.C. Allen Chan et al. Hypermethylated RASSF1A in Maternal Plasma: A Universal Fetal DNA Marker that Improves the Reliability of Noninvasive Prenatal Diagnosis Clinical Chemistry 2006;52(12):2211-2218 BstU I methylation-sensitive restriction enzyme CG’CG, GC’GC 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

24. DNA-Methylierungin vivo-Bedeutung der DNA-Methylierung Eukaryonten Epigenetik - Genexpression Hypermethylierung führt zur Suppression der GenExp. Prokaryonten Schutz vor DNA anderer Organismen Methylierung blockiert Enzym-Schnittstelle eigener DNA - fremde (Bakteriophagen-) DNA wird zerstört 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

25. DNA-Methylierungin vitro-Bedeutung für die fetale Diagnostik Enzymatische Verdauung der mütterlichen Plasma-DNA fetale Methylierung blockiert die Restriktionsschnittstelle  die methylierte fetaleGensequenz bleibt erhalten  die maternale Sequenz wird zerstört Die Menge der fetalen DNA kann gemessen werden 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

26. Amplifikationskontrolle für fetale DNAmethyliertes fetales RAASF1A Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNA Abb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

27. RHD-NIPD SAFE-Protokoll Abb.3: RHD negativer männlicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

28. RHD-NIPD SAFE-Protokoll Abb.5: RHD positiver weiblicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

29. Amplifikationskontrolle für fetale DNAmethyliertes fetales RAASF1A Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNA Abb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

30. EntscheidungsbaumbeiVerwendung von RASSF1A und ACTB für das Prä- natale RHD-Screening nach Chan et al. Clinical Chemistry 2006;52(12):2211-2218 4

31. ZusammenfassungNicht-ivasive pränatale RHD-Diagnostik bei Antikörperträgerinnen • Frühzeitiger Ausschluss RHD-negativer Feten • Vermeidung invasiver Diagnostik Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

32. ZusammenfassungNIPD: Kriterium zur Indikationsstellung der Anti-D-Prophylaxe • Hohe Sicherheit gegenüber falsch positiven Ergebnissen • Vermeidung unnötiger Anwendung von humanem Anti-D • Unabhängigkeit von der Verfügbarkeit von Anti-D 4 Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

33. RHD-NIPD Arbeitsgruppe Elisabeth Schwartz-Jungl1 Dieter Schwartz1 Claudia Hobel2 Christof Jungbauer2 Josef Deutinger3 Peter W. Husslein3 W. R. Mayr1,2 1 Universitätsklinik für Blutgruppenserologie und Transfusionsmedizin, Medizinische Universität Wien 2 Österreichisches Rotes Kreuz, Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland 3 Universitätsklinik für Frauenheilkunde, Medizinische Universität Wien Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

34. www.blut.at • www.roteskreuz.at Österreichisches Rotes Kreuz Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland www.blut.at www.roteskreuz.at Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland