Конструкция чипа Affymetrix

1. Профили экспрессии (паттерны) различаются у нормальных и раковых клеток или при различных типах рака. Излечимые и неизлечимые виды лейкозов дают разные паттерны. По виду паттернов можно с большой вероятностью предсказать течение болезни на самой ранней стадии.

2. Конструкция чипа Affymetrix PM = perfect match MM = mismatch

3. Этапы обработкидля чипов Affymetrix (фирма Affymetrix) • Привязка к сетке (gridding) • Вычисление значений интенсивности зондов • 3. Поправка на глобальный фон • 4. Поправка на неспецифическую гибридизацию • 5. Вычисление устойчивого среднего логарифмов поправленных значений в зондах. • 6. Масштабирование сигналов чтобы подрезанное среднее имело фиксированное значение

4. Проблемы первоначального подхода:1. MM>PM (60-85% генов, где это выполняется хотя бы для одного зонда) Решения А) Заплатка Affymetrix: идеальный mismatch Б) А MM вообще не нужен. Вероятностная поправка на фон в методе RMA. В) Нет, все-таки будем использовать MM, но с учетом теоретически вычисленного сродства данной олигонуклеотидной последовательности. GC-RMA

5. Проблемы первоначального подхода:2. Эффект зонда – вариация интенсивности одного гена, померянная разными зондами не случайна. Модель Ли-Вонга. Eg – истинная экспрессия гена g, fi – чувствительность i-ой пары PM-MM. PMgi –MMgi =fi Eg + Шум Произвольное требование, необходимое для идентификации (f12 +…+fk2)/k =1

6. Визуальная проверка на присутствие нелинейной зависимости от интенсивности. М-А график. Mg=log(Ig(1)/Ig(2)) Ag=(1/2)log(Ig(1)*Ig(2)) M 0 A

7. Проблемы первоначального подхода:3. Нелинейная зависимость от интенсивности. Mg=log(Ig(1)/Ig(2)) Ag=(1/2)log(Ig(1)*Ig(2))

8. Линейная регрессия 1 y = a+bx MINa,b((y1-(a+bx1))2+(y2-(a+bx2))2+…+(yk-(a+bxk))2)

9. Линейная регрессия 2 Часто бывает полезно выбрать в качестве начальной точки отсчета средние значения измеряемых величин. Малиновой и желтой точкой показаны величины стандартного отклонения х и у.

10. Линейная регрессия3 • Здесь в качестве единиц измерения выбраны среднеквадратичные отклонения для х и у. • Тогда уравнение прямой, лучше всего приближающей наше облако точек имеет очень простой вид: • y= R*x • R – коэффициент корреляции х и у.При нашем выборе единиц измерения и начал отсчета • R=(x1y1+x2y2+…+xnyn)/n R=0.0995, y= 0.995x

11. Локально-линейная регрессия (loess)

12. МА график посленормализации Mn =M – Mloess(A)

13. Квантильная нормализация

14. Квантильная нормализация

15. МА графики для различных иголок принтера кДНК микрочип

16. Поиск генов с одинаковым уровнем экспрессии в разных образцах • Housekeeping гены • К сожалению, не все housekeeping гены имеют посстоянный уровень экспрессии. Примеры:b -актин, GAPDH, • 2. Гены инвариантного ранга • 3. Контрольные гены • Контроли гибридизации bioB, bioC, bioDи cre Гены E. coliи б/ф P1, биотинилированные сRNA транскрипты которых вводят в смесь для гибридизации в разных концентрациях (1,5, 5, 25, 100 pM для bioB, bioC, bioDи cre, соотв.). BioB – на пороге чувствительности (1:100000).

17. Возможная последовательность этапов обработкидля чипов Affymetrix 1 Вычисление “сырых” значений интенсивности зондов (Affymetrix MicroArray Suit) 2. Поправка на глобальный фон (Affymetrix MAS5) 3. Loess нормализация на уровне зондов (и PM и MM зонды) 4. Вычисление модельного индекса экспрессии (Ли и Вонг, dChip) 6. Квантильная нормализация индексов экспрессии

18. Чего с чем нормализуем? • И квантильная и лоесс нормализация применяется к паре чипов. Для нормализации совокупности чипов чаще всего выбирают (строят) базовый чип и нормализуют все к нему. • а) Базовый чип – это реально существующий чип, нравящийся автору. • б) Базовый чип конструируется. Как правило, это чип, где значение каждого гена равно медиане множества значений этого гена по всем чипам, которые хочется нормализовать. • 2. Для квантильной нормализации можно сводить распределение каждого чипа к множеству средних квантилей или к множеству квантилей распределения, построенного по всем чипам сразу. • 3. Для лоесс нормализации существует алгоритм “циклический лоесс”.

19. Чтоможет измерить ДНКчипChoe et al. Genome Biology 2005, 6:R16 1 1 14000 генов на чипе 2551 1.2 87 2 1 141 1.5 1 85 2.5 1.2 1 1 3 180 1 90 2.0 88 1 1.5 2 14000 генов на чипе 1 186 4 1 1.7 90 1 180 1 183 1

20. Что может измерить ДНК-чип? А) Choe et al. Genome Biology 2005, 6:R16 Насколько хорошо ДНК чип выясняет, какие вообще гены экспрессированы? • очень плохо на уровне пары зондов – из зондов, прошедших через порог, 10% принадлежат отсутствующим генам, а остальные включают только 60% присутствующих генов • Лучше на уровне генов – из генов, прошедших через порог, 10% принадлежат отсутствующим генам, а остальные включают 85% присутствующих генов.

21. Что может измерить ДНК-чип? А) Choe et al. Genome Biology 2005, 6:R16 Насколько хорошо ДНК чип выясняет, какие гены дифференциально экспрессированы? • Плохо, если считать, что дифференциально экспрессированные означает увеличившиеся более чем на 20% (из 1309 генов 380 не находятся (29%), а ошибочно находятся 105(10% от всех найденных). На самом деле ни один из генов, увеличивших экспрессию на 20% не был найден, и лишь половина изменившихся на 50% была найдена. • Хорошо, если рассматривать лишь гены, изменившие экспрессию более чем на 100% (не находится лишь 7% от так изменившихся при 10% ошибочно найденных )

22. Возможно ли сравнение результатов различных экспериментов? В работе Multiple Lab Comparison of MicroarrayPlatforms, Rafael A. Irizarry et al., 2004 рассматриваются результаты измерения одних и тех же образцов разными лабораториями на разных платформах. Эффект лаборатории очень велик и превосходит эффект платформы. Заметим, что эффект нормализации, особенно такой, где все образцы нормализуются к одному экспериментальному образцу, уменьшая вариабельность результатов отдельного эксперимента, затрудняет сравнивание различных экспериментов.

23. Литература • Exploration and analysis of DNA microarray and protein array data. D. Amaratunga, J. Cabrera, Wiley 2004. • Statistical analysis of gene expression microarray data. Edited by T. Speed. Chapman and Hall, 2003. • Statistics for microarrays. E. Wit, J. McClure, Wiley, 2004 • Analyzing microarray gene expressing data. G. McLachlan, Kim-Anh Do, C. Ambroise, Wiley, 2004 • Bioinformatics and computational biology solutions using R and Bioconductor. R. Gentleman, V. Carey, W. Huber, R. Irizzary, S. Dudoit, Springer, 2005.