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Walter Gilbert (1932)

Walter Gilbert (1932). Marcaje radiactivo y separación de las hebras del ADN. C only: Hydrazine in 1.5 M NaCl, piperidine. C+T: Hydrazine, piperidine. G only: DMS, piperidine. A + G: DMS, formic acid, piperidine. Rompe el ADN mediante 4 reacciones químicas específicas.

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Walter Gilbert (1932)

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Presentation Transcript

  1. Walter Gilbert (1932)

  2. Marcaje radiactivo y separación de las hebras del ADN

  3. C only: Hydrazine in 1.5 M NaCl, piperidine C+T: Hydrazine, piperidine G only: DMS, piperidine A + G: DMS, formic acid, piperidine Rompe el ADN mediante 4 reacciones químicas específicas

  4. Detalles sobre las rupturas químicas específicas

  5. Electroforesis y reconstrucción de la secuencia

  6. ¿Cómo se reconstruye la secuencia?

  7. Esquema general del proceso

  8. Frederick Sanger (1918)

  9. Artículo donde publica su método

  10. El método de Sanger

  11. 1.- Preparación de los 4 tubos

  12. 2.- Polimerización y terminación de la cadena (ddT)

  13. 3.- Electroforesis y reconstrucción de la secuencia

  14. El Premio Nobel de Química (1980)

  15. Secuenciación automatizada del ADN

  16. + Kary B. Mullis (1944) Frederick Sanger (1918) Secuenciación cíclica del ADN = Sanger + PCR

  17. TdTAMRA (600 nm) AdR6G (570 nm) GdROX (620 nm) CdR110 (540 nm) 4 ddNTPs fluorescentes distintos

  18. C R-110 A R6G T TAMRA G ROX Cada ddNTP emite una fluorescencia de distinto color

  19. template Se puede hacer la reacción en un solo tubo, no en 4

  20. Los productos de la PCR terminan con un ddNTP fluorescente

  21. Cada color representa a un nucleótido terminal

  22. Electroforesis y reconstrucción de la secuencia

  23. Electroferograma La electroforesis capilar es mucho más rápida

  24. La electroforesis capilar se hace a gran escala

  25. Electroforesis y reconstrucción de la secuencia

  26. Electroferograma Cada electroferograma secuencia entre 400 y 900 bases

  27. Pirosecuenciación

  28. Las reacciones de la pirosecuenciación

  29. 1. Hibridación del cebador

  30. 2. Liberación de pirofosfato (o no)

  31. 3. Pirofosfato + APS  ATP + luciferina  luz

  32. 4. La apirasa degrada todos los nucleótidos (reset)

  33. 5. Los dNTP se van añadiendo de forma secuencial

  34. Pirograma Reconstrucción de la secuencia (hasta 700 pb)

  35. James Watson (1928) Pirosecuenciación de un genoma completo

  36. Otros métodos para secuenciar el ADN

  37. Evolución del coste de secuenciar el ADN

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