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荧光定量 PCR 技术在 临床检测中的应用

荧光定量 PCR 技术在 临床检测中的应用. 中山大学 中山医学院生物化学教研室 达安基因股份有限公司首席科学家 朱振宇 医学博士、教授、博士生导师 Tel ： 13922430138 ， 020 － 37656430. PCR 发展简史. PCR (Polymerase Chain Reaction). 1983 Cetus 公司的 Kary Mullis 于 12 月 16 日第一 次成功实验发明了 PCR 1985 关于 PCR 的文章首次由 Kary Mullis 及其同事等人 在 《Science》 上 发 表

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荧光定量 PCR 技术在 临床检测中的应用

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  1. 荧光定量PCR技术在 临床检测中的应用 中山大学 中山医学院生物化学教研室 达安基因股份有限公司首席科学家 朱振宇 医学博士、教授、博士生导师 Tel：13922430138，020－37656430

  2. PCR 发展简史 PCR(PolymeraseChain Reaction) 1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成功实验发明了PCR 1985 关于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人 在《Science》上 发 表 1989 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry 1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测

  3. PCR循环 PCR循环次数与DNA产量关系 循环次数 DNA的链数 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 2201,048,576 30 2301,073,741,824 10亿 PCR特点：高效扩增、忠实复制

  4. PCR反应的特点 • 灵敏度高 • 快捷 • 简便 • 对样品纯度要求低 • 可以相对定量

  5. FQ-PCR Ct值的意义 Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同 Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次扩增

  6. 荧光定量PCR的临床应用 • 感染性疾病的诊断 • 母婴传播的控制与观察 • 遗传疾病的诊断 • 肿瘤的诊断 • 法医学鉴定

  7. 早期诊断 • 病情评估和预后判断 • 抗病毒药物疗效的观察、指导 • 新药验证

  8. 临床应用 一 感染性疾病 1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的监控、预测与预防

  9. 临床应用 • 二 肿瘤 • 1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等 • 2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因

  10. 三 遗传病 • 1. 等位基因检测 • 2. 多基因遗传病的突变检测 • 3. 基因表达异常所致遗传病检测

  11. 临床应用 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 一 肝炎病毒定量检测 二 性病病原体检测 三 结核杆菌及呼吸道病原体检测 四 优生优育(TORCH)相关项目检测

  12. 临床应用 • 　肝炎病毒定量检测 • HBV • HCV

  13. HBV （一） 乙型肝炎病毒结构及特点 HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内， 　　　　一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM 　　　　提示HBV处于复制状态 HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好

  14. HBV （二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态； FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。 2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。

  15. HBsAg(－) HBV-DNA(＋) HBeAg (－) HBV-DNA(＋) HBV （二） HBV-DNA与“两对半” 3. 血清学指标(－)不能排除HBV感染。 4. 也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。 5. HBsAb (＋) 、 HBcAb (＋) 、 HBeAb (＋)三抗体阳性 与HBV DNA 2.5× 103 copy /ml 结果解释。

  16. HBV (三)HBV-DNA定量检测的临床意义 1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性 2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效 a. 专家提出<103 copy /ml做为阴性或临床治愈标准 b. HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后) c. 拉咪呋啶 3. HBV-DNA定量与预后 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌变的几率明显高于含量低者

  17. HBV感染与干扰素治疗 治疗前： a: 治疗前HBV低水平复制者对干扰素的反应性明 显优于高水平复制者。 b: 治疗前HBV DNA 含量特别高者大多没有疗效。 c: HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV DNA 含量较低者。

  18. HBV感染与干扰素治疗 治疗中： a: 病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。 b: 相反，治疗期间HBV DNA复制水平下降较慢， 或下降幅度较小，或者变化不明显者，大多是 干扰素治疗无效。

  19. HBV感染与干扰素治疗 • 治疗后： • a: 治疗结束后，采用PCR定量法检测，HBV • DNA <103 copy/ml 者，可能不再复发。 • b: 终止治疗后HBV DNA 仍保持较低水平者， • 反跳的可能性较大。

  20. CHRONIC HEPATITIS B ALT HBV DNA HBe Ag HBs Ag Normal Alt 0 1 2 3 4 5 6 12 24 治疗前 Months after Start of Therapy Poor Response to IFN Therapy

  21. 拉咪呋啶： 有显著降低高病毒载量作用，近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV变异，患者易出现耐受性，而且容易出现停药后反弹。 HBV感染与拉咪呋啶治疗

  22. 0 -20 -40 -60 -80 -100 安慰剂 血清HBV DNA; 中位%变化 拉米夫定 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 n=192 n=404 n=171 n=359 治疗周数 拉米夫定抑制血清HBV DNA

  23. 5. 肝脏移植与HBV-DNA Mazzaferro等报告：< 103copy /ml 无一例再发肝炎 >105copy /ml 发生了严重HBV再感染 HBV (三)HBV-DNA定量检测的临床意义 4. HBV-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查 6. 血液制品和献血员的筛选

  24. HCV （一）丙型肝炎病毒特点 病毒特点： 1. 单正链RNA病毒 2. E1和E2区基因高度变异性 • 感染特点： • HCV在血中含量极微 • 输血后肝炎主要致病因子 • 免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一 • 有一部分人感染HCV后，不产生抗-HCV • 感染易于慢性化(50-85%) • 疫苗研制尚不成功 单链RNA

  25. HCV (二)HCV-RNA定量检测的临床意义 1. 早期诊断 a. 临床以< 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。 b. HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。 c. 严格筛选献血员 ,提高对窗口期感染者的检出率。 d. 医疗纠纷中的“举证倒置”，病人入院前后进行HCV-RNA检测。

  26. HCV (二)HCV-RNA定量检测的临床意义 2. HCV-RNA载量与抗-HCV滴度、ALT水平之间的相关性。 抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。 3. HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。 4. 慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这时如果进行HCV-RNA 定量检测可以鉴别活动性、复制程度。

  27. STD 二　常见性传播疾病病原体 一　淋球菌（NGH） 二　沙眼衣原体（ CT ） 三　解脲脲原体（UU） 四　梅毒螺旋体（TP） 五　单纯庖疹病毒（HSV） 六　乳头瘤病毒（HPV） 七　人类免疫缺陷病毒（HIV） 八 EV71 A16 通用型

  28. 艾滋病 艾滋病是英文AIDS（Acquired Immunity Deficiency Syndrome) 的中文译音，全称是“获得性免疫缺陷综合征”。它可以由人类免疫缺陷病毒（HIV,Human-being Immunity Deficiency Virus ），又称艾滋病病毒引起的疾病。当病毒侵入人体后，经一段时间的潜伏期，破坏人体的免疫力，从而发病，病死率高，是一种严重的传染病。

  29. 艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定传播途径传播的慢性传染病，属于《传染病防治法》中规定的乙类传染病艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定传播途径传播的慢性传染病，属于《传染病防治法》中规定的乙类传染病

  30. HIV病毒：多亚型和多变异 HIV-1和HIV-2 M组、O组和N组 亚性型：A-K CRF：基因重组亚型，主要是HIV-1型 毒株亚型监测的意义 不同亚型与不同传播途径的关系：B主要通过男性同性性行为和静脉注射吸毒传播，C主要异性性接触传播 流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的C亚型和B亚型 重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的B/A重组流行、泰国的A/E重组

  31. 艾滋病病毒在外界的抵抗力 HIV病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很快消失 HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多 对HBV有效得消毒和灭活方法均适用于HIV

  32. HIV感染的三种结局 典型进展者：8-10年潜伏期后成为艾滋病人，80% -90% 快速进展者：CD4细胞2-5年内迅速下降，HIV病毒载量一直维持较高水平，而且分离的HIV有均一性。 长期存活者（又称长期不进展者）：维持15年以上，而且CD4计数维持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。

  33. 艾滋病的诊断 HIV感染者：确定HIV感染的个体 抗体检测：初筛和确认 辅助诊断 艾滋病病人：临床诊断标准见国家标准《HIV/AIDS的诊断标准和防治原则》 GB16000-1995

  34. 荧光定量PCR的应用为艾滋病的初筛和辅助 检查提供了有力的工具

  35. NGH 淋球菌感染与致病 1. 人是淋球菌的惟一宿主。 2. 发病率最高，在所STD疾病中，高达60%左右。 3. 发病趋势： a. 男性多于女性。 b. 城市走向农村， c. 高收入阶层向低收入阶层扩展 4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。 5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎

  36. CT 沙眼衣原体感染与致病 1. 严格的细胞内寄生。 2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原体。 3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害 性已超过淋球菌而居STD之首。 4. 在我国，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。 5. 泌尿生殖道感染，妨碍妊娠。 6. 盆腔感染，可致生殖能力损害。

  37. UU 解脲脲原体感染与致病 • 合成尿素酶，分解尿素 2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率仅次于衣原 体感染，居第二位。 3. 流产超过4次以上者，检出率高达80%。 4. 有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。 5. 与男性不育相关。男性不育患者精液中，脲原体检出率高达66.6％。检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高。

  38. NGH/CT/UU 荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义 1. 非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。 2. 对无症状或症状轻者，可以早期确诊。 3. 对NGH、CT、UU 等混合感染者，诊断和鉴别诊断。 4. 指导用药、考核疗效。

  39. NGH/CT/UU 荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义 5. 不孕不育、优生优育。 6. 流行病学调查，为性传播疾病的监控提供依据。 7.CT、UU是FDA批准的PCR检测试剂盒，可作为首选 方法，在临床推广应用。

  40. HPV 人乳头瘤病毒感染与致病 1. HPV具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是HPV的惟一宿主。 2. 有100多个型。 3. 低危型：HPV 6、11引起良性病变 (尖锐湿疣、喉乳头瘤等)

  41. HPV 人乳头瘤病毒感染与致病 4. 高危型：HPV 16、18引起恶性肿瘤 (宫颈癌、 肛门癌、口腔癌等) 5. 免疫原性低，易形成持续性感染。 6. 新生儿产道感染。

  42. HPV

  43. 1. 对典型病例可以明确诊断。 2. 对临床表现和组织病理改变都不典型的病例同样可以做出诊断。 3. 对亚临床和隐性HPV感染做出诊断。 4. 基因分型。 5. 考核疗效与预后。 6. 病毒载量与患癌症风险。 HPV 荧光定量PCR检测HPV的意义

  44. HPV

  45. 手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD） 为全球性传染病，世界大部分地区均有流行的报道。 • 1957年在加拿大首次报告，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原； • 1959年提出HFMD命名，HFMD在全球广泛流行，无明显的地域分布。 • 之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV 71引起的手足口病流行。 • 发热, 不适, 咽喉肿痛, 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡 传染性极高 病程约1周

  46. HFMD的病原 • 手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括 CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯萨 奇B组病毒, 以CoxA16 和 EV71最为常见 • 传播途径: 粪-口途径传播: 唾液与粪便; 呼吸道传播: 空气飞沫;接触传播 • 疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。 • HFMD为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布, 但 近年EV71在东南亚一带流行, 引起较多的重症和死亡病例。 • 在80年代和90年代，中国手足口病的流行主要以 CoxA16为主，2008年，CoxA16 和EV71 共循环引起手 足口病爆发, EV71在大部分省市为优势病毒。

  47. 进入途径 口腔/呼吸道 咽喉及下肠胃道 传播 飞沫、接触、饮食 扁桃体、深层淋巴结、肠道淋巴结 先天性感染 微病毒血症 肝脏、 胰脏、 肾上腺 心脏 神经系统 呼吸系统 皮肤及黏膜 肌肉 病毒血症 神经系统 抗体产生、病毒血症消失，病毒感染症状改善 人肠道病毒感染的一般致病机制

  48. 致病特点 ①隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。 ②病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。 ③不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现。 ④感染过程中形成病毒血症。

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