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1. Vinoterapia e turismo del benessere e del vino. Stati Generali della Vinoterapia nel Borgo Terminio Cervialto. Castelfranci-Montella (AV), 18 Gennaio 2008. Vino e resveratrolo, dall’edonismo alla scienza. Prof. R. V. Iaffaioli Direttore UO Oncologia Medica I.N.T. G. Pascale, Napoli

2. Da sempre l’uomo ha avuto la tendenza di affidarsi al mondo vegetale e fra le massime sue aspirazioni vi era quella di poter risolvere i problemi di salute o di alleviare i dolori procurati da ferite e malattie; da ciò lo stimolo di conoscere i segreti della natura, le caratteristiche del mondo vegetale, le sue proprietà e il conseguente impiego di fiori, frutti e piante.I monaci, profondi conoscitori del mondo vegetale, fin dal Medioevo vantavano i loro "giardini dei semplici" dove venivano coltivate quelle piante necessarie alla cura dei malati, quegli infusi ricostituenti, quegli elisir di erbe corroboranti del corpo e dello spirito.Lo sviluppo delle rotte marittime e della navigazione in genere, favorirono l’ingresso in Europa di numerose piante sconosciute, alcune delle quali con proprietà straordinarie, come la corteccia della china (India) per la cura delle febbri malariche, la coca (America) da usare come anestetico, …L’uso del microscopio (fine XVII secolo), poi, permise una migliore comprensione della struttura delle piante che comportò, nel XIX secolo, un approfondimento degli apprendimenti, tale da arrivare a conoscere l’istologia dei tessuti vegetali; queste conoscenze portarono alla nascita di una "scienza dei tessuti“ e alla individuazione dei componenti chimici contenuti nelle piante, alcuni dei quali possono, oggi, essere prodotti, per sintesi, in laboratorio come è il caso del cortisone ottenuto con un processo di semi-sintesi dalle agavi e dalle igname.

3. Evidenze ormai datate suggeriscono che un buon consumo di frutta e verdura rappresenti una strategia pratica per ridurre l’incidenza di malattie croniche, quali il cancro, ma anche di patologie cardiovascolari o legate all’invecchiamento. Peraltro c’è anche evidenza che il rischio neoplastico cresca in assenza di un buon consumo di frutta e verdura per: presenza nella dieta di sospette sostanze cancerogene. assenza nella dieta di composti dalle proprietà anti-tumorali (chemiopreventivi).

4. E’ stato stimato che in media il 35% delle morti per cancro è associata a fattori nutrizionali. Da oltre 25 anni, negli Stati Uniti e non solo, vengono promossi programmi di prevenzione e linee guida sull’alimentazione allo scopo di ridurre il rischio di cancro e di patologie cardiovascolari ed alcune decine di molecole vengono studiate in trials clinici. Doll R., Peto R., 1981; Sporn MB, 2002; Redy L. 2003; Greenwald P., 2004

5. L’utilizzo di agenti naturali o farmacologici per sopprimere, arrestare o invertire la cancerogenesi negli stadi iniziali viene definito chemioprevenzione. Se da una parte il termine chemioprevenzione viene adoperato attualmente anche per indicare la capacità di curare il cancro, dall’altra si indica ormai come chemiopreventivo uno stile di vita, quale può essere una corretta alimentazione.

6. Recentemente il National Cancer Institute (NCI), riferendosi alle numerosissime ricerche degli ultimi anni sull’attività anti-tumorale delle molecole naturali, ha identificato oltre 40 piante commestibili contenenti composti, noti generalmente come fitochimici, potenzialmente dotati di effetto chemiopreventivo. Pertanto è utile distinguere tra chemioprevenzione “farmacologica” ed “alimentare”. Sur Y. J., 2003; Aggarwal B.B., 2006 Iaffaioli 2008

7. Fitochimici e antiossidanti. Si elencano tra i fitochimici classi di composti non nutritivi presenti in frutta e verdura: carotenoidi, polifenoli, alcoloidi, composti contenenti nitrogeno e composti organo - sulfurei. I polifenoli comprendono: acido - fenolico, tannini, stilbeni, coumarine e flavonoidi. Per la gran parte, essi possiedono proprietà antiossidanti, da cui l’”ipotesi antiossidanti” nella prevenzione del cancro. Liu R.K, 2004

10. Le mutazioni somatiche che subisce una singola cellula e che si esprimono in graduali modulazioni del fenotipo, da cellula normale a pre-neoplastica e neoplastica, caratterizzano il processo di “carcinogenesi multifase”. Gli stadi si identificano in : iniziazione (può durare da alcune ore ad alcuni giorni), promozione (dura un numero variabile di anni) e progressione (1-5 anni). Nell’inizio, che è irreversibile, avviene l’aggressione diretta sul DNA da parte di agenti cancerogeni, fisici o chimici.

11. La promozione è di solito lenta e reversibile ed è caratterizzata dall’accumulo di cellule pre-neoplastiche già caratterizzate da anomala proliferazione. La fase finale della carcinogenesi con acquisizione di invasività e potenziale metastatico rappresenta il momento della progressione, solitamente irreversibile. Tra promozione e progressione si attivano dei proto-oncogeni e/o vengono inattivati i geni onco-soppressori. I geni in causa, una volta mutati, provocano alterazioni nei processi della cellula normale che regolano la crescita e la proliferazione.

12. Ad un efficace farmaco chemiopreventivo si richiede di interferire con una o più fasi della cancerogenesi. Pertanto dovrebbe garantire: prevenzione primaria in soggetti sani ad alto rischio; prevenzione anti – neoplastica in soggetti con lesioni pre-maligne; prevenzione di forme secondarie in pazienti già trattati per tumore primario. Kakkizoe T., 2003; Tsao A.S.; 2004 Iaffaioli 2008

13. Chemioprevenzione alimentare Una dieta ricca di frutta e verdura contiene numerosi fitochimici che sono potenziali agenti chemiopreventivi, per buona parte già selezionati per studi clinici in corso o incipienti. Due gruppi principali di fitochimici vengono attualmente considerati. Alcuni di questi agiscono come cancro - bloccanti in quanto impediscono ai composti cancerogeni l’iniziazione del bersaglio cellulare, sia: 1.modificando l’assorbimento ed il metabolismo dei cancerogeni, 2. eliminando le specie ossigeno reattive (ROS), 3. incrementando la detossicazione, 4. innescando meccanismi di riparo del DNA.

14. Si definiscono invece cancro - soppressori quei composti che intervengono nelle fasi di promozione e progressione delle cellule pre-neoplastiche. Questi composti sono caratterizzati dalla capacità di interferire con: regolazione del ciclo cellulare, trasduzione del segnale, regolazione trascrizionale, apoptosi. Le neoplasie che originano da stomaco, esofago, polmone, testa-collo, endometrio, pancreas e colon risultano positivamente influenzate da un’alimentazione ricca di frutta e verdura , come risulta da numerosi studi epidemiologici (Mathew A, 2004; Wong AH, 2005). Viene in tal modo confermata la convinzione, da tempo diffusa, che lo stile di vita può essere in causa nel determinare l’insorgenza delle neoplasie, più che il bagaglio genetico individuale. Iaffaioli 2008

15. I radicali superossido o idrossilici, più instabili, ed il perossido di idrogeno, più stabile, sono in grado di danneggiare il DNA. In effetti nelle cellule tumorali è stata descritta una maggiore produzione di ROS, soprattutto nelle prime fasi di vita del cancro. E da questa convinzione nasce il razionale della chemioprevenzione alimentare: incrementare la presenza di anti-ossidanti allo scopo di diminuire le ROS, per proteggere le cellule normali dalle trasformazioni cancerose.

16. RESVERATROLO Il resveratrolo (3,5,4' - triidrossistilbene) è un fenolo non flavonoide presente nella buccia dell'acino d'uva, ma anche in altri frutti e piante (mirtilli, more, prugne etc), avente azione antifungina, antiteratogena,antineoplasticae di fluidificazione del sangue e che può limitare l'insorgenza di placche trombotiche. Inoltre di grande interesse è la possibilità di impiego nella sindrome di Alzheimer ed altre forme di demenza.

19. Quantità nei vini Resveratrolo Totale nei vini (mg/L) Muscadine Wines 14.1 - 40 Vini Rossi 1.98 - 7.13 Rossi Spagnoli 1.92 - 12.59 Succo di vini rossi spagnoli 1.14 - 8.69 Vini Rose’ 0.43 - 3.52 Pinot nero 0.40 - 2.0 Vini Bianchi 0.05 - 1.80 Vini Toscani da 0,3 a 2,1 mg per litro

20. ROSSI vs Bianchi Le quantità presenti nei rossi sono dovute alla fermentazione fatta in presenza di buccia di acino e dipendono dalla lunghezza della fermentazione in PRESENZA di bucce e semi. Le bucce fresche contengono fino a 100 mcg di resveratrolo per grammo!

23. L’“ipotesi antiossidanti” afferma che “essendo gli antiossidanti in grado di prevenire o ridurre il danno ossidativo, un loro incremento nell’alimentazione riduce il rischio di malattie croniche (Stanner S. A., 2004)”. Se talvolta è ancora discussa l’ipotesi che la protezione dal cancro passi attraverso la capacità di eliminare le ROS, è cresciuta negli ultimi anni l’evidenza sperimentale che gli antiossidanti nei cibi possano agire come chemiopreventivi indipendentemente dalla loro capacità di interferire sulle ROS. I meccanismi di azione suggeriti sono: 1. modulazione di fattori di crescita. 2. Inibizione di oncogeni ed attivazione dei geni cancro-soppressori,induzione della differenziazione terminale, attivazione dell’apoptosi, ripristino della risposta immune, inibizione dell’angiogenesi, riduzione dell’infiammazione. Iaffaioli 2008

24. Effetti del resveratrolo sull’angiogenesi. E’ stato dimostrato che il resveratrolo sotto - regola la produzione di alcune citochine angio-genetiche, inclusi VEGF, ed Interleukina - 8 (Cao Y. ,2002). Ma l’effetto protettivo del resveratrolo sulle cellule vascolari viene anche ascritto alla sua relazione con l’eliminazione delle specie ossigeno-reattive (ROS). Infatti un ROS, come il perossido di idrogeno stimola l’espressione di mediatori angiogenetici, tra cui il VEGF (Colavitti R., 2002; Grzenkowicz-Wydra J., 2004). Molti dei risultati in vitro sono stati confermati in vivo. Infatti alcuni studiosi hanno dimostrato che il resveratrolo, anche somministrato nell’acqua da bere di pulcini e topi, inibisce la crescita cellulare dell’endotelio capillare, ritardando anche la crescita di fibrosarcomi ma anche i processi di cicatrizzazione, che dipendono da angiogenesi (Brakenhilm E.,2001).

25. In altre esperienze e con diverse modalità sperimentali è stato dimostrato che i polifenoli del vino rosso hanno un chiaro effetto atero-protettivo inibendo la crescita delle placche aterosclerotiche. Di fatto, in altri studi è dimostrato che la crescita delle placche aterosclerotiche è correlata al grado di neo-vascolarizzazione e che altri inibitori, come l’endostatina riducono il grado di aterosclerosi (Moulton K.S, 2003). L’effetto proapoptotico è frequentemente dimostrato anche per il resveratrolo estratto da altre fonti come la radice della pianta Poligonum cuspidatum, in grado di prevenire la crescita di neoplasie polmonari e di metastasi polmonari nei topi di Lewis (Kimura Y.,2000 e 2001). E’ anche vero però che l’estratto di vinaccioli può stimolare l’ossigenazione delle ferite, anche se questo effetto viene attribuito ai tannini ed alle pro-antocianidine (tannini condensati) (Sen C.K., 2002).

27. Nutraceutica (1) L’uso dei prodotti a base di erbe e di nutraceutici sta diventando sempre più popolare e tali composti vengono spesso considerati come farmaci alternativi ritenendoli intrinsecamente sicuri, solo perché di origine “naturale”. Ma vanno considerati svariati problemi: 1. Gli estratti non standardizzati delle piante contengono vari composti che possono influenzare in maniera diversificata l’angiogenesi, le capacità proliferative delle cellule ed il comportamento della matrice extra-cellulare; 2. come ogni sostanza chimica anche quelle derivate dalle piante possono esercitare vari effetti ed interazioni con vari pathways metabolici. Pertanto, tutti composti contenuti debono essere testati accuratamente in termine di sicurezza e di interazioni, anche con farmaci potenzialmente assunti dai consumatori; 3. molte osservazioni suggeriscono che i composti isolati da piante che costituiscono cibi locali o rimedi tradizionali, possono esercitare potenti effetti benefici ma è anche possibile che tali effetti rappresentino soltanto eventi occasionali in casi particolari. Iaffaioli 2008

28. Nutraceutica (2) 4. Le indicazioni per i potenziali terapeutici delle varie piante possono essere completamente diverse dall’attività confermata dei composti botanici bioattivi. Per esempio: la berberina, nota come efficace anti-diarroico si è rivelata un forte induttore del recettore di LDL e, da allora in poi, considerata potenziale farmaco per la dislipidemia. Gli alcaloidi vincristina e vinblastina, utilizzati per la terapia del cancro, erano in origine derivati da piante usate per la cura del diabete. Pertanto, la prova della reale efficacia dei composti derivati dalle piante richiede test rigorosi e studi clinici randomizzati. Iaffaioli 2008

29. Fitofarmaci e biodisponibilità Una delle principali caratteristiche di un potenziale agente chemiopreventivo è la sua “safety”: poiché coloro che lo ricevono potrebbero essere soggetti “sani”, va somministrato a dosi inferiori rispetto ai classici chemioterapici. Ciononostante, è evidente che negli studi scientifici realizzati le concentrazioni risultano superiori, specialmente per i flavonoidi che sono i polifenoli più abbondanti nella nostra alimentazione e con un grado variabile di capacità antiossidante. L’ostacolo vero perché le loro proprietà biologiche vengano esplicate, è rappresentato dalla loro biodisponibilità. Bisogna inoltre considerare il diverso comportamento metabolico in ragione delle quantità somministrate o ingerite, il diverso destino metabolico, il vario livello di coniugazione , la diversa distribuzione. La generale scarsa biodisponibilità dei singoli composti, insieme con le complesse reazioni trasformative, rende difficile l’analisi causa-effetto.

30. Proprietà anti-invecchiamento del resveratrolo Negli ultimi anni un gruppo di studiosi che fa capo a D. Sinclair ha dimostrato una potente attivazione della trascrizione e funzione di sirtuina (Sir2, SIRT1-7 nei mamiferi), che sono deacetilasi coinvolte nel processo di gene-silencing dell’ invecchiamento, che bloccano l’apoptosi e favoriscono la sopravvivenza cellulare (Howitz K.T., 2003; Ziegler C.C., 2004; Signorelli P., 2005; Lagouge M., 2006).

31. Questo effetto descritto sembra contraddire l’”ipotesi anti-ossidanti”: come chemiopreventivo e anti-ossidante, il resveratrolo contrasta la produzione delle ROS e inibisce la proliferazione cellulare; come anti-age, la stessa molecola incrementa il metabolismo mitocondriale e la produzione di ROS, migliorando la sopravvivenza cellulare. Inoltre, il resveratrolo mette in discussione le funzioni dell’istone deacetilasi nella terapia tumorale: infatti, mentre gli “inibitori” di istone deacetilasi rappresentano nuove e potenti farmaci chemioterapici, il resveratrolo apparentemente funziona allo stesso modo “attivando i medesimi enzimi”. Iaffaioli 2008

32. Controversie e biodisponibilità I problemi creati dalla biodisponibilità in vivo della molecola potrebbero in parte spiegare queste apparenti contraddizioni. Infatti il resveratrolo alimentare viene rapidamente assorbito e si trova nel plasma come glucuronide o solfato; nel vino o altre alimenti il suo metabolismo può essere inibito da altre polifenoli per reazione competitive con gli enzimi che gli metabolizzano. In tal modo si ha una maggiore concentrazione della forma libera, impercettibile nel plasma. Pertanto il diversificato comportamento funzionale può essere prerogativa delle diverse concentrazioni. In sintesi sembra che a concentrazioni molto basse prevalga l’attività anti-age, viceversa le più elevate concentrazioni farmacologiche sembrano esaltare le proprietà anti-tumorali del resveratrolo. Gli alti dosaggi sembrano comunque inappropriati per un impiego chemiopreventivo. Iaffaioli 2008

33. Resveratrolo e malattia di Alzheimer Recenti studi ed osservazioni epidemiologiche confermano un ruolo favorevole del resveratrolo in disordini neurologici come le ischemie acute e croniche, la malattia di Huntington e la malattia di Alzheimer. Il resveratrolo è in grado di mimare una restrizione calorica in molti organismi e, se questo effetto può essere una tra le cause anti-invecchiamento,è chiamato in causa anche per l’inibizione dell’aterosclerosi. In effetti il resveratrolo sembra generare i vantaggi della restrizione calorica senza causare il conseguente stress nutrizionale da malnutrizione.

34. In studi recenti (Parker J.A., 2005; Bedalov A., 2004) è stato dimostrato il ruolo di protezione del SIRT dalla degenerazione neuronale nella malattia di Alzheimer. In particolare il resveratrolo sembra proteggere le funzioni neuronali nella ischemia cerebrale cronica e da ictus e nell’epilessia, ma anche nella tossicità indotta da alcuni composti chimici. Altri effetti protettivi dei neuroni sembrano correlati all’attività anti – ROS, anti-H2O2 anti- NO, anti – ß-amiloide (Jun W., 2006; Maranbaund Ph., 2005; Anekonda T.S.,2006). Iaffaioli 2008

35. Particelle -Vettore Nanosfere di Ac.Ialuronico Liposomi Nanotubi Vescicole lipidiche

36. Complessazione in molecole -vettore

37. Resveratrolo –Ac Ialuronico La molecola di resveratrolo “embedded” in un polimero di ac. Ialuronico. E’ possibile anche aggiungere fluoresceina per tracciare la particella.

40. La nanofabbricazione La nanofabbricazione, nel senso più stretto del termine, riguarda un insieme di tecniche che consentono di costruire oggetti, dispositivi e materiali "piccoli" delle dimensioni di un miliardesimo di metro, dove "piccolo" significa una resa migliore, più economico, operazioni più veloci e più alte prestazioni (G.Whiteside, Harvard University; P.Alivisatos, U.California Fundamental Scientific Issue For Nanotecnology http://www.nano.gov). In un senso più ampio la nanofabbricazione riguarda una delle diverse discipline dell'ingegneria di precisione che sfrutta l'insieme di tali tecniche per realizzare piccole strutture 3D che possono trovare applicazione in diversi settori principalmente dell'industria elettronica, ma ora anche in quello biomedico.

41. Caratteristiche Molti farmaci presentano caratteristiche biofarmaceutiche e/o farmacocinetiche sfavorevoli per essere somministrati per una via che non sia quella parenterale. Queste sostanze, sebbene molto attive, non riescono a raggiungere il sito d'azione in quantità sufficiente, a causa di problemi d'assorbimento, distribuzione, emivita o stabilità. I loro difetti biofarmaceutici sono solitamente affrontati con modifiche chimiche della struttura. Questo intervento cambia le proprietà della molecola che impediscono una pronta metabolizzazione, un'accettabile stabilità e un adeguato assorbimento, dando però origine ad una nuova sostanza (2). Da alcuni anni la realizzazione di nuovi prodotti passa anche attraverso strategie che non comportano la modifica della molecola. La tecnologia, ad esempio, può affiancarsi alla chimica per consentire ad una sostanza di disperdersi rapidamente, di mantenersi stabile e di farsi trasportare attraverso le mucose (3,4)

42. La tecnologia farmaceutica può mascherare la struttura chimica, permettendo alla molecola di superare i passaggi critici per la sua biodisponibilità; in questo modo non si producono nuovi farmaci ma nuovi medicamenti. Se si considera che il farmaco nuovo è gravato da una mole di studi farmaco-tossicologici e clinici, sviluppare un farmaco conosciuto in un'innovativa forma di dosaggio permetterebbe di ottenere un nuovo prodotto a costi più bassi, rivalutando così sostanze attive più promettenti, già provate su un gran numero di pazienti (2). La disponibilità biologica dei farmaci quindi può essere ottimizzata con la tecnologia. Ogni farmaco ha bisogno di una formulazione che ormai non è più soltanto una decorazione estetica, ma riveste un ruolo essenziale per la sua azione. Per queste ragioni le preparazioni farmaceutiche possono portare contributi di rilievo non solo all'attività terapeutica, ma anche agli aspetti socio-economici ed industriali. Un classico esempio di questa strategia è il rilascio modificato di farmaco che studia nuove preparazioni per prolungare l'azione del farmaco (5,6,7). Questi preparati sono nuovi medicamenti che hanno anche fatto scoprire nuove proprietà farmacologiche di farmaci noti ma trascurati. Essi permettono di ottenere cessioni di farmaco legate alla reale necessità, aprire nuove vie di somministrazione e raggiungere obiettivi mirati (5).

43. A proposito di biodisponibilità Le condizioni di solubilità, stabilità e permeabilità spesso condizionano lo sviluppo biofarmaceutico per una somministrazione extravascolare. Un mezzo moderno per uno sviluppo biofarmaceutico efficace è l'utilizzo di nano/microvettori al fine di cambiare le proprietà sfavorevoli del farmaco (5,9). Le nano/micro-tecnologie farmaceutiche consentono la fabbricazione di preparati in forma di particelle colloidali da usare come vettori di farmaco (10). Tali particelle, per la loro struttura e composizione, possono modificare il destino del farmaco senza cambiarne la struttura chimica. Le particelle come vettori sono sistemi di rilascio per farmaci poco solubili, poco assorbiti e instabili. In conclusione un'applicazione programmata delle nano/microtecnologie può produrre ottimizzazione di sostanze critiche (11,12,13). In questo sviluppo delle conoscenze rimane sempre la necessità di trovare nuovi vettori, in particolare di approntarne d'intelligenti, in grado cioè di liberare il farmaco in funzione di stimoli esterni o di portarlo in maniera precisa al suo bersaglio.

44. Il punto di forza del presente progetto si basa su una nuova tecnologia di rilascio (slow delivery) di un agente antitumorale grazie all’utilizzo di nanosfere polimeriche in grado di migliorare l’assorbimento del farmaco da parte delle cellule tumorali e la loro affinità. Il progetto di ricerca si basa sullo sviluppo di un processo che permetta di creare dei depots (gels) provvisori attraverso iniezione intra-tumorale.; una volta in situ, i depot vengono degradati lentamente rilasciando il farmaco. Sebbene ci siano numerosi farmaci anticancro nel mercato, il loro uso è limitato per gli effetti tossici che causano ai tessuti normali. Incapsulando i farmaci in nanosfere, è possibile controllare il rilascio del farmaco in modo da non raggiungere il livello di tossicità. Ingegnerizzando le microparticelle in modo da avere come target il tessuto tumorale è possibile ridurre ulteriormente la tossicità e aumentare contemporaneamente l'indice terapeutico.

47. E L’IMMORTALITA’?