Obtención de datos cinéticos y modelos matemáticos de inactivación

1. EVALUACIÓN DE RIESGOS CUANTITATIVO VALORACIÓN DE LA EXPOSICIÓN Obtención de datos cinéticos y modelos matemáticos de inactivación

2. COMMISSION REGULATION (EC) No 2073/2005 of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs Article 3 As necessary, the food business operators responsible for the manufacture of the product shall conduct studies in accordance with Annex II in order to investigate compliance with the criteria throughout the shelf-life. In particular, this applies to ready-to-eat foods that are able to support the growth of Listeria monocytogenesand that may pose a Listeria monocytogenesrisk for public health.

3. Annex II • When necessary on the basis of the above mentioned studies, the food business operator shall conduct additional studies, which may include: • predictive mathematical modelling established for the food in question, using critical growth or survival factors for the micro-organisms of concern in the product,

4. Sistemas de gestión de la seguridad alimentaria Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (APPCC) Microbiología Predictiva Análisis de Riesgos

5. Obtención de datos cinéticos de termoresistencia

6. Obtención de datos cinéticos de termoresistencia Tratamiento isotermo (Tª constante) Tratamiento no isotermo (Rampa de Tª) (Rampa de Tª-Tª constante)

7. Llenado de capilares (100 μl) Cerrado a la llama 50- 57.5 ºC durante 10 a 120 s Tratamiento térmico Siembra y recuento L. plantarum CECT (220) [ ] inicial 8 9 x 10 ufc/ml Fase estacionaria TRATAMIENTO TÉRMICO DE Lactobacillus plantarum EN SUERO DE JUGO DE NARANJA

8. Capilares Data logger Baño calentamiento Baño enfriamiento

9. Detalle termorresistómetro

11. Generalidades sobre los modelos matemáticos predictivos

12. La forma tradicional de establecer la seguridad de un alimento es mediante un test de desafio. El método más antiguo partió de la conservación por calor y es lo que se denomina: Inoculación experimental de envases

13. La técnica tiene inconvenientes: Es cara Es lenta  Requiere habilidades microbiológicas y laboratorios  Cuando se cambia la formulación de un producto o un perfil tiempo-temperatura, es necesario repetir el test de desafio

14. La alternativa es entender con más profundidad la respuesta de los microorganismos a los factores medioambientales del alimento y desarrollar la forma de interpolar respuestas microbiológicas mediante cálculo Microbiología Predictiva

15. Microbiología Predictiva Campo de estudio que combina elementos de microbiología, matemáticas y estadística para desarrollar modelos que describan y predigan matemáticamente el crecimiento o muerte de los microorganismos, cuando se les somete a condiciones medioambientales específicas (Whiting, 1995).

16. Los modelos son descripciones simplificadas de la realidad • La realidad descrita por el modelo se denomina Espacio Modelo

17.  Los modelos deben reflejar lo que está pasando y deben ser capaces de predecir con precisión los estados presente y futuro de las cosas que describen  Hay que ser conscientes de que un modelo no puede dar una representación total de la realidad. Un modelo particular puede describir algún aspecto de forma muy adecuada mientras que falla en la descripción de otro

18. Suposiciones en modelización Espacio Modelo: No se puede modelizar todo, hay que escoger la parte de la realidad que se quiere modelizar. A esto se le llama espacio modelo y no tiene conexión con el resto de la realidad realidad espacio modelo

19. Espacio modelo: Se define como todos los factores que juegan un papel en la determinación del fenómeno bajo estudio, los conocidos y no conocidos

20. Fenómeno: Los modelos se usan para describir relaciones entre variables dependiente e indepen- dientes. V. dependiente Fenómeno Relación V. Independientes

21. Para poder modelizar un fenómeno en un espacio modelo determinado es necesario entender la relación entre las variables dependiente e independientes. Este ejercicio ayudará a elegir el modelo apropiado Variables dependientes: tiempo de tratamiento Variables independientes: Número final de microorganismos

22. Microbiología predictiva El objetivo de la microbiología predictiva es conseguir un Espacio Modelo para describir un Fenómeno de forma matemática o probabilística Espacio modelo Medioambiente Temperatura pH aw Respuesta microbiana Fenómeno Crecimiento Inactivación

23. La microbiología predictiva no revela, generalmente, comportamientos inesperados de los microorganismos. La microbiología predictiva cuantifica los efectos de la interacción entre dos o más factores y permite la interpolación de combinaciones de factores no comprobados de forma explícita

24. Clasificación de los modelos Modelos de nivel primario: Modelo de Bigelow Modelos de nivel secundario: Superficie de respuesta Modelos de nivel terciario: Tejedor y Martínez

25. Los modelos de nivel primario describen cambios en el número de microorganismos u otras respuestas microbianas con el tiempo. crecimiento inactivación

26. Los modelos secundarios describen las respuestas de los parámetros de los modelos primarios a los cambios en las condiciones medioambientales superficie de respuesta Ln(spec.g.rate) pH NaCl (%)

27. Los modelos terciarios son programas de ordenador que transforman a los modelos primarios y secundarios en herramientas de facil uso para los usuarios del modelo Inactivación crecimiento

28. Consideraciones en el desarrollo de un modelo Precisión en el ajuste.  Capacidad de predecir combinaciones de factores no probadas.  Incorporación de todos los factores relevantes.  Que tenga el mínimo número de parámetros.  Especificación del término de error.  Los parámetros deben tener un significado biológico y valores realistas.  Reparametrización si se mejoran las propiedades estadísticas.

29. Bacillus stearothermophilus 7 6 5 4 Log N experimental 3 predicho 2 1 0 116 118 120 122 124 126 128 Temperatura (ºC) Termoresistencia y Modelos primarios de inactivación/supervivencia

30. Modelos de inactivación: Velocidad alta de muerte de los microorganismos por la acción de un agente activo Modelos de supervivencia: Disminución de la carga microbiana de forma mas lenta y no implica esterilidad comercial Los modelos matemáticos son los mismos en ambos casos

31. Modelos primarios A) Modelos logarítmicos La modelización matemática comenzó en 1920 con los cálculos de tiempo de destrucción térmica. Los valores D y Z se usaron con éxito para asegurar que los alimentos enlatados estaban libres de riesgo de alteración por Cl. botulinum Estos modelos establecen la relación existente entre el tiempo y la inactivación de un microorganismo a una temperatura dada.

32. Los datos experimentales para la obtención de los parámetros, D y Z, que definen la inactivación de los microorganismos se pueden analizar de diferentes maneras: • Dos regresiones lineales consecutivas •  Una regresión no lineal en un solo paso

33. Curva de supervivencia 3 Log. supervivientes 2 DT 1 Tiempo de exposición

34. Curva de muerte térmica DT2 Log DT DT1 z T1 T2 Temperatura

36. Una regresión no lineal Tratamiento isotérmico 1 = - × log N log No t - æ ö T T R ç ÷ è ø × z D 10 R

37. Tabla 1. Parámetros cinéticos predichos para dos cepas de Bacillus cereus Temperature D value (min) (ºC) AV TZ415 AV Z421 Linear Non-linear Linear Non-linear a a ± ± 85 ND ND 16 5 17.1 0.5 a a ± ± 40 20 39 3 90 ± ± 3.9 0.7 4.04 0.08 ± ± 95 11 3 9.8 0.5 ± ± 0.94 0.17 0.95 0.02 100 ± ± 2.5 0.4 2.48 0.06 ± ± 0.22 0.06 0.225 0.007 105 ± ± 0.60 0.19 0.63 0.03 ND ND ± ± ± ± z (ºC) 8.1 0.3 7.97 0.10 8.0 0.6 8.4 0.2 not determined. ND a ± D value confidence interval (95%).

38. 3 2.5 2 Log (No/N) observed 1.5 1 0.5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Log (No/N) predicted 4 3 Log (No/N) observed 2 1 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Log (No/N) predicted Curvas de equivalencia

39. 25 20 15 Frequency 10 5 0 -0.3 -0.2 -0.1 0.1 0.2 0.3 0 (Log Nexp - Log Ncal) 35 30 25 20 15 Frequency 10 5 0 -0.7 -0.46 -0.22 0.02 0.26 0.5 (Log Nexp - Log Ncal) Residuos normales con media cero

40. CÁLCULO DE LAS REGIONES DE CONFIANZA

41. 9.1 8.7 8.3 z (ºC) 90ºC AV TZ415 7.9 95ºC AV Z421 7.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 D (min) Regiones de confianza conjunta

42. Efecto del pH sobre el valor D del B. stearothermophilus en ensaladilla 14 14 115 ºC 118 ºC 12 12 Z (ºC) 10 10 Z (ºC) 8 8 6 6 1 2 3 4 5 2 4 6 8 10 12 D (min) D (min)

43. Efecto del pH sobre el valor D del B. stearothermophilus en ensaladilla 14 14 125 ºC 121 ºC 12 12 Z (ºC) Z (ºC) 10 10 8 8 6 6 0 1 2 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 D (min) D ( min )

44. Diferentes tipos de curvas de supervivencia Hombro 3 Concavidad hacia abajo Lineal Log. supervivientes 2 Concavidad hacia arriba Cola 1 Tiempo de exposición

45. Los hombros se han atribuido:  a la necesidad de mas de un evento dañino  a la necesidad de una activación de las esporas

46. Presencia de colas Teoría vitalista Distribución de termorresistencia La termorresistencia depende del ciclo celular en que se recoja Teoría mecanicista

47. Presencia de artefactos experimentales Mezcla de poblaciones Otras explicaciones Nueva aproximación La curva de supervivencia es una forma acumulativa de distribución de eventos letales con el tiempo Cada organismo individual o espora de una población muere a un tiempo específico

48. Curvas con hombros 1 85°C 0.1 90°C 0.01 95°C AVTZ415 strain 0.001 S(t) (N/No) 100°C 0.0001 0.00001 0 8 16 24 32 40 Time (min)

49. n æ ö t ç ÷ - = a è ø S(t) e Función de supervivencia MODELO DE WEIBULL a= Scala n= Forma

50. El parámetro de forma “n” se puede considerar como un índice de comportamiento Si n >1 describe una curva con hombro Si n < 1 describe una curva con cola Si n = 1 la curva de supervivencia sera lineal en coordenadas semilogarítmicas y se comportará como una reacción de primer orden El parámetro de escala “a”se puede considerar como una constante de velocidad de reacción. Similar al Valor D