COLTIVAZIONE DEI BATTERI Substrati di crescita: Terreni di coltura

1. COLTIVAZIONE DEI BATTERI Substrati di crescita: Terreni di coltura 1. terreni definiti: si conosce l'esatta composizione chimica Es. Terreno per Escherichia coliquantità (g/l) Glucosio 1,0 Na2HPO4 16,4 KH2PO4 1,5 (NH4)2SO4 2,0 MgSO4.7H2 200,0 CaCl2 10,0 FeSO4. 7H2O 0,5 PH finale 6,8-7,0

2. b) Terreni complessi: la composizione chimica di alcuni componenti non è esattamente conosciuta Es. Alcuni tra i più comuni terreni complessi Brodo nutritivo quantità (g/l) Peptone (idrolisato di gelatina) 5 Estratto di carne di manzo 3 TSB (Tryptic Soy Broth) Triptone (digesto pancreatico della caseina) 17 Peptone (digesto della farina di soia) 3 Glucosio 2,5 Cloruro di sodio 5 Fosfato di potassico 2,5 Agar MacConkey quantità (g/l) Digesto pancreatico di gelatina 17,0 Digesto pancreatico di caseina 1,5 Digesto peptico di tessuto di animale 1,5 Lattosio 10,0 Sali biliari 1,5 Cloruro di sodio 5,0 Rosso neutro 0,03 Cristal violetto 0,001 Agar 13,5

3. Stato fisico dei terreni A-Terreni liquidi B-Terreni solidi: a base di agar o di gelatina Agar: miscela di polisaccaridi estratti da alghe rosse Punto di fusione > 80°C Punto di solidificazione < 45°C Aggiunto nella proporzione dell’1-2% (0,5% per terreni semisolidi) Tranne alcuni batteri marini, i batteri non possiedono enzimi in grado di attaccare l’agar Gelatina: sostanza di natura proteica che si ottiene per azione dell’acqua bollente sui collageni Punto di fusione e di solidificazione: 25°C Aggiunta nella proporzione del 10-20% I terreni a base di gelatina si usano per identificare i batteri che Possiedono enzimi in grado di attaccare la gelatina (batteri fluidificanti la gelatina)

4. Terreni colturali liofilizzati

5. Crescita in terreno liquido: lo sviluppo batterico è evidenziato da intorbidamento del terreno Crescita su terreno solido: lo sviluppo batterico dà origine alla formazione di colonie o di patina

6. Tipi di terreno A-Terreni di base (es. Triptic soy broth)) di uso generale. Consentono la crescita di molti microrganismi B-Terreni arricchiti: al terreno base si aggiungono varie sostanze a seconda delle esigenze nutrizionali del batterio: es latte, sangue, vitamine, aminoacidi, ecc. C-Terreni di arricchimento: terreni selettivi liquidi nei quali lo sviluppo del batterio che si vuole isolare è favorito rispetto a quello dei contaminanti. Si fa seguire una sottocoltura in terreno selettivo solido.

7. D-Terreni selettivi: contengono sostanze batteriostatiche nei confronti della flora microbica contaminante ma senza azione nei confronti del batterio ricercato che è quindi favorito nello sviluppo. E-Terreni indicatori: oltre ai normali costituenti contengono sostanze che sono modificate in maniera facilmente apprezzabile dal batterio ricercato o dai batteri contaminanti in modo che le colonie degli uni siano facilmente evidenziabili dalle colonie degli altri. Es. Gli enterobatteri patogeni non fermentano il lattosio; Escherichia coli fermenta il lattosio con produzione di metabolici acidi che sono messi in evidenza con un indicatore di pH

8. Nutrient agar: le colonie crescono indifferenziate

9. A B Agar Eosina Blu di Matilene (EMB) Blu di metilene: inibisce la crescita della maggior parte dei batteri Gram positivi Eosina: colorante che passa da incolore a nero quando il mezzo diventa acido A-Batteri lattosio non fermentanti: colonie incolori B-Batteri lattosio fermentanti:centro scuro con riflessi verde metallico delle colonie

10. B A Agar Salmonella Shigella (agar SS) Sali biliari: inibiscono la maggior parte dei Gram positivi Rosso neutro: indicatore rosso a pH acido e incolore a pH basico A- batteri lattosio fermentanti B- batteri lattosio non-fermentanti C-batteri lattosio non fermentanti produttori di acido solfidrico C

11. pH Si controlla il pH mediante pHmetro L’aggiustamento del pH si fa mediante aggiunta di NaOH o HCl diluiti Al terreno si possono aggiungere indicatori di pH per evidenziarne le variazioni es. Blu di bromotimolo Rosso metile Rosso congo Rosso fenolo Rosso neutro I terreni prima della semina del campione devono essere sterili In genere sono sterilizzati in autoclave I terreni acquosi contenenti sostanze termolabili sono sterilizzati per filtrazione La vetreria è sterilizzata mediante aria calda (stufe a secco)

12. I terreni prima della semina del campione devono essere sterili STERILIZZAZIONE: ha lo scopo di distruggere qualsiasi microrganismo presente in un dato materiale DISINFEZIONE:ha lo scopo di distruggere microrganismi patogeni ANTISEPSI: tende a distruggere microrganismi sulla cute, ferite, sostanze

13. Sterilizzazione A- Calore Il calore agisce denaturando le proteine e disgregando la membrana citoplasmatica I vari microrganismi possiedo diversa sensibilità al calore Tempo di morte termica:tempo richiesto per sterilizzare una sospensione microbica ad una determinata temperatura

14. Tempi di morte termica approssimativi per microrganismi con diversa resistenza Acqua Vapore Calore seccobollentesotto ressione 160°C 180°C 100°C 121°C 132°C min min min min min Molto sensibile Batteri asporigeni Virus 3 <1 2 1 <1 Miceti Poco resistente Clostridium perfingens (spore) 4 <1 5 2 <1 Virus dell’epatite Moderamente resistente Clostridium septicum (spore) 4 <1 10 3 <1 Bacillus anthracis (spore) Molto resistente B.stearothermophilus Clostridium botulinum 30 5 30 12 2 (spore) Termofili del terreno 60 10 <500 25 4

15. 1- Calore secco - Incenerimento - Flambaggio - Aria calda: Metodo di scelta per la sterilizzazione di vetreria di laboratorio, siringhe di vetro, materiale di porcellana, ecc. Si usano particolari stufe a doppia parete I genere si sterilizza a : 160°C per 2 ore 180°C per 1 ora

16. 2-Calore umido A-Acqua bollente 100°C per 5-10 minuti non si ottiene la sterilizzazione Si può aumentare l’azione microbicida aggiungendo disinfettanti chimici B-Vapore Deve essere: - Privo di aria: Impedisce al vapore di venire a contatto con il materiale La temperatura è quella della miscela aria e vapore - Saturo e non surriscaldato: deve avere una temperatura non superiore a quella corrispondente a una data pressione temperatura pressione (Atm) 100 0,00 112 0,5 121 1 128 1,5

17. 1-Vapore fluente Pentola di Koch 100°C per 30-60 minuti Le spore batteriche non vengono uccise Tindalizzazione Consiste nel riscaldamento di materiali organici per 20-45 minuti, ripetuto per tre giorni di seguito → si ottiene l’uccisione delle spore

18. 2-Vapore sotto pressione Autoclavi: apparecchi a perfetta tenuta resistenti alla pressione Sono provviste di: Termometro Manometro Rubinetto di espurgo

19. Il ciclo di sterilizzazione comprende 4 fasi: 1- Caricamento del materiale Il materiale non deve essere ammassato 2- Riscaldamento preliminare Si portano temperatura e pressione ai livelli desiderati I tappa: si scalda a 100°C con l’orificio di espurgo aperto II tappa: si chiude l’orificio di espurgo La temperatura sale fino al livello richiesto 3-Sterilizzazione temperatura e pressione sono mantenuti a livelli costanti per un determinato periodo tempi di sterilizzazione: 121°C per 15 minuti 115°C per 30 minuti 4- Raffreddamento L'autoclave non va aperta fin tanto che all'interno la pressione è superiore a 1

20. B-Filtrazione Per soluzioni acquose termolabili

21. Sterilizzazione dell'ambiente di lavoro A- Raggi ultravioletti (260 nm) Sono caratterizzati da: - lenta attività d'azione - scarso potere di penetrazione ( non attraversano vetro, superfici solide, strati di sporco, ecc.) Lampade UV sono applicate al soffitto delle stanze o nelle cabine a flusso laminare Il personale non deve essere esposto in quanto i raggi UV provocano ustioni della cute e danneggiano gli occhi

22. B- Cappe a flusso laminare

23. Semina Su terreno solido: a) disseminazione in superficie

24. Semina per disseminazione in superficie

25. B) semina per inclusione Il campione deve essere liquido

26. Semina per inclusione

27. Condizioni di incubazione Vanno rispettate le esigenze di crescita dei batteri (temperatura e atmosfera. Per i batteri anaerobi si deve garantire l'assenza di ossigeno

28. La semina in un terreno di coltura premette: 1.La conta batterica A-Carica batterica totale: su tereni solidi

29. 2. Isolamento e identificazione L'identificazione dei batteri si esegue su coltura pura: terreni contenenti una sola specie batterica si ottiene prelevando una sola colonia cresciuta su tereno solido e la si semina in un altro terreno Si basa su: 1- attività metabolica dei batteri A- inoculo di una porzione di colonia sospetta in una serie di terreni di coltura contenenti substrati particolari e indicatori che evidenziano le variazioni di pH e la presenza di cataboliti

30. B- Sistemi di identificazione rapida es. API 20E API 20 non E

31. 2- carattere morfologico Osservazione microscopica dei batterì 3- carattere antigenico 4- carattere genetico Studio di specifiche sequenze del DNA