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CURSO PRÉ – CONGRESSO: Citometria de fluxo DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS

CURSO PRÉ – CONGRESSO: Citometria de fluxo DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS. Dr. João Carlos de Campos Guerra Departamento de Patologia Clínica - HIAE Centro de Hematologia de São Paulo - CHSP.

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CURSO PRÉ – CONGRESSO: Citometria de fluxo DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS

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  1. CURSO PRÉ – CONGRESSO: Citometria de fluxo DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS Dr. João Carlos de Campos Guerra Departamento de Patologia Clínica - HIAE Centro de Hematologia de São Paulo - CHSP

  2. CLASSIFICAÇÃO “REAL”/ WHO (98) Revised European Classification of Lymphomas and World Health Organization • ENTIDADES (LEUCEMIA / LINFOMA) BASEADAS EM DADOS: • CLÍNICOS • MORFOLÓGICOS • SP, MO, BMO, Biópsia de outros tecidos • IMUNOLÓGICOS • Imunofenotipagem por citometria de fluxo • Imunocitoquímica / Imunohistoquímica • CITOGENÉTICOS (FISH ) e MOLECULARES (PCR) • Anormalidades genéticas com valor prognóstico

  3. NEOPLASIAS DE CÉLULA B • PRECURSORAS: • Leuc. / Linf. Linfoblástico de Célula B Precursora • PERIFÉRICAS: • LLC cel-B / Linf. de Pequenos Linfócitos • Leucemia Pró - Linfocítica de Célula B • Linfoma linfoplasmocitóide / Imunocitoma • Linfoma de células do manto • Linfoma de centro folicular / folicular • Linf. B da Z. M. / esplênico / extranodal (tipo MALT) / nodal • Tricoleucemia ; Plasmocitoma ; Mieloma Múltiplo • Linfoma de Grandes Células B Difuso • Subtipos: Mediastinal (tímico) e Intravascular • Linfoma de Burkitt

  4. NEOPLASIAS DE CÉLULA T e NK- • T PRECURSORAS : • Leucemia / Linfoma Linfoblástico T precursora • T e NK PERIFÉRICAS: • LLC de célula T e Leucemia Pró -Linfocítica • Leucemia de Linfócitos Grandes Granulares • Leucemia Tipo célula T e Tipo célula NK • Micose Fungóide e Síndrome de Sézary • Linfoma de Célula T periférica Não Especificado • Doenças Linfoprolif. Cutâneas Prim. Cell T CD30+ • Linfoma de Célula T γ/δ Hepatoesplênico • Linfoma de Célula T Tipo Paniculite Subcutânea • Linfoma de Célula T Angioimunoblástico • Linfoma de Célula T Intest.(assoc.ou não a enteropatia) • Leucemia/ Linfoma de Células T do Adulto, HTLV1+ • Linf.Grandes Células Anaplásico, CD 30+, Tipos T e Nula • Linfoma de Grandes Células Anaplásico, Tipo Hodgkin (REAL: provisório)

  5. Célulado plasma Pró-B Pré-B BImatura B Naïve Centroblasto Centrócito IgM IgM MemóriaB IgD DH-JH VH-DHJH VL-JL Mutações somáticas Medula óssea Linfonodo Geração e maturação de células B Mudança Adpatado de Félix Reyes durante o EHA 2003 em Lyon, França, 12-15 de Junho

  6. Célula tronco Célula pré-pré B Célula pré-B Célula pré-B TDT Célula B imatura Célula pré-B Célula B madura Célula B ativada Plasmó- cito CD 19 CD 20 CD 22 CD 38 CD 21 Maturação das células B normais e expressão do CD20

  7. Expressão antigênica na linhagem de células-B doentes LLA LLC, LLPC Burkitt, LF, LDGC, TL MW MM Célula tronco Pré-B B precoce B Intermediária B- Madura B Plasmacitóide Plasmócito ±CD5 CD19 CD20 CD22 CD52 ? ? ?

  8. Doenças Linfoproliferativas crônicas CITOMETRIA DE FLUXO • Determinação da linhagem das células malignas • Detecção de clonalidade • Análise da maturação celular e heterogeneidade dentro das populações celulares malignas • Avaliação da expressão antigênica

  9. LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA LLC-B é a mais comum leucemia nos EUA. Incidência : 27 casos por 100.000 hab./ano – 40% leucemia > 65 anos Ásia e Japão a incidência é mais baixa, sendo inexplicável essa observação. É de 20-30x mais comum na Europa, Austrália e Norte América Os pacientes com LLC comumente tem mais de 50 anos, com idade média de 65 anos. Rara <30 anos. 20-30% ~ 55 anos Incidência homem/mulher de 2:1, No estadiamento de Raí : Bom prognóstico: score 0, Intermediário :I e II e Pobre prognóstico :III e IV.

  10. CARACTERÍSTICAS LABORATORIAIS NO • DIAGNÓSTICO DA LLC-B • Linfocitose periférica > 5.000/mm3 • Linfocitose >30% na medula óssea • Imunoglobulina de superfície monoclonal de intensidade baixa • comumenteIgM e Kappa (62%), Lambda (2%), CD19 (70%), CD20 (71%), HLA-DR (70%). CD19 ou CD20 / CD5 e CD23 (+). • Marcadores T: CD3 (24%), CD5 (93%), CD7(28%). • Marcador de monócitos: CD14(5%). • Resultados negativos para CD10 (Linfoma Folicular) • FMC-7 (LPL), CD25/CD103 (Hairy cell) antígenos de célula T, • outros que não CD5 (neoplasia de célula T), CD79B e CD22 • Rearranjo gênico de imunoglobulina (+) • Estudo citogenético: usualmente normal; trissomia do 12 é • relativamente específica.

  11. Figura 1: LLC-B (Linfócitos maduros, Sombras celulares de Gun Precht e Prolinfócito)

  12. LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA-SP

  13. LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA

  14. Figura 3: Histogramas característicos da LLC-B: Células linfóides B com restrição de cadeia kappa (baixa expressão) e expressão antigênica de CD5+ e CD20+ (baixa expressão). 76,9% de células CD19 (+) CD19/Kappa + Kappa de B.Ex CD19/CD5 +

  15. Sistema de Escore para diagnóstico da LLC Escores em LLC são geralmente >3, nas outras doenças células B são geralmente <3.

  16. Fatores prognósticos em LLC

  17. Figura : LLC com anormalidade citogenética: Trissomia do 12 por cariótipo convencional e hibridização in situ por fluorescência (FISH).

  18. Figura 2: A Síndrome de Richter (5-10%) é a transformação da LLC em um Linfoma difuso de grandes células. Histologia da medula óssea Infiltrado intersticial e nodular de células linfóides maduras, intermediadas por células hematopoéticas normais. No caso de infiltração difusa maciça associa-se o quadro com um pior prognóstico. A infiltração paratrabecular não é normalmente observada na LLC.

  19. LEUCEMIA PRÓLINFOCÍTICA LPL pode ser “de novo” ou secundária a LLC. A definição de LPL: > 55% de prólinfocitos no S.P. LLC/LPL : 10% a 55% LLC < 10% A freqüência de LPL é de 10% em relação as LLCs. Média de idade: 70 anos Presença de esplenomegalia volumosa, raramente hepatomegalia e adenomegalia. Na LPL-T a linfoadenomegalia é vista em 50% dos casos e hepatomegalia em 40%, infiltração de pele em 27% dos pacientes. A meningite leucêmica tem sido relatada, com tratamento intratecal eficaz. É comum a doença em estágio avançado (Raí IV ou Binet C). A média de sobrevida da LPL é de 2 a 3 anos, comparado com 8 anos de LLC. Curso clínico variável. Anemia e trombocitopenia Relacionado com sobrevida curta. Pacientes com LPL-T apresentam média de sobrevida de 7 a 7,5 meses, e raramente sobrevivem por 2 anos.

  20. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA LEUCEMIA PRÓLINFOCÍTICA • Leucometria >100.000/mm3 • Prólinfócitos >55% no sangue periférico • Em Citometria de Fluxo linfócitos grandes com • fluorescência intensa • 4. Ig de superfície monoclonal, mais comum IgM - kappa • 5. LPL-B: Positivo: CD19,CD20,CD22,FMC-7,HLA-DR e • Negativo: TdT,CD10,CD5 (2/3) • 6. LPL-T: TdT-,CD2+,CD3+,CD5+,CD7+,CD4+/CD8- (55-64%) • CD4+/CD8+ (21-30%), CD4-/CD8+ (10-13%) • 7. Rearranjo gênico de imunoglobulina na LPL-B • 8. Rearranjo gênico de receptor de célula T na LPL-T • Anormalidades citogenéticas: 14q+ para LPL-B, • inv(14)(q11q32), t(14;14)(q11;q32) e trissomia 8q para LPL-T. • 25% do pct – t(11;14)(q13;q32) – Linfoma do manto- evolução leucêmica • nestes pacientes?

  21. Figura 6: LPL:O nucléolo único e proeminente é característico do prólinfocito.

  22. COMPARAÇÃO ENTRE LLC, LLC/LPL, LPL LLCLLC/LPL LPL Leucócitos(x109) 10-120 intermediário >100 Pro linfócitos (%) <10 10-55 >55 Infiltração esplênica infreq. intermediário presente Adenomegalias freq intermediário raro Ig de superfície fraca bifásica intensa CD 5 (+) pres. bifásica <30% FMC-7 (+) <20% <20% presente Anorm.Citogenéticas trissomia 12 trissomia 12 14q+

  23. LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRONICA DE LINHAGEM T LLC-T é rara, sendo 1% a 2% das LLC. A Leucemia de células T é um grupo heterogêneo de doenças: - Leucemia/Linfoma da célula T do Adulto (LLTA) - Doença de Linfócitos Grandes Granulares (LGLD) ou também chamada de Doença Linfoproliferativa T- Gamma - Leucemia Prólinfocítica de célula T (LPL-T) O grupo britânico acredita que a LLC-T é uma variante da LPL-T pela similaridade clínica, genética e pela microscopia eletrônica (nucléolo). O grupo da Clínica Mayo classifica junto com a LLC-B pela morfologia. Na classificação Americana/Européia de Linfoma está em estudo e na Organização Mundial da Saúde (WHO) foi excluída, como entidade separada.

  24. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE LLC-T Linfocitose > 5.000/mm3 Células leucêmicas: predomínio de linfócitos maduros Linfocitose de medula óssea > 30% Expressão de um ou mais antígenos T: CD2, CD3, CD5, CD7 Fenótipo mais freqüente : CD4(+) Rearranjo gênico: TCR Citogenética: t(14:14)(q11;q32), inv (14;14)(q11;32) TdT e CD1 : negativos

  25. Figura 5: LLC-T / LPL-T: Linfócitos pequenos com alta relação N/C, núcleo redondo, nucléolo pequeno ou ausente. Ausência de grânulos no citoplasma.

  26. LEUCEMIA DE CÉLULAS CABELUDAS - (HAIRY CELL LEUKEMIA) A incidência de HCL é de 2% do total das leucemias Seu diagnóstico é essencial pela possibilidadae de cura Linfocitose de longo tempo, hepatoesplenomegalia e três punções secas. Anemia 85%, trombocitopenia 60 - 80% e leucopenia 60%

  27. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE HAIRY CELL LEUKEMIA • Células leucêmicas com projeções citoplasmáticas finas • Pancitopenia com monocitopenia • TRAP positivo • Imunofenótipo Positivo para: CD11c, CD22, CD25, • FMC-7 e CD103 • Imunohistoquimica: DBA-44 (+) • Imunoglobulina de superfície monoclonal • Características histológicas: Medula óssea com aspecto de “ovo frito”, “favo de mel” • Formação de pseudosinus em baço • Lesão angiomatosa em fígado • Microscopia Eletrônica : Projeções citoplasmáticas finas e complexo ribossomo-lamela • 9. Rearranjo gênico de imunoglobulina

  28. Leucemia das Células Cabeludas / Tricoleucemia: Células de hairy cell com as delicadas projeções citoplasmáticas em toda superfície celular.

  29. Análise da Hairy cell Leukemia por Citometria de Fluxo Histograma CD19 x Granularidade Histograma Volume x Granularidade Hairy cell Hairy cell Linfocitos B Linfocitos B

  30. SISTEMA DE ESCORE PARA LLC Diferente do anterior em relação Ao CD22(-) / CD79b = 1 ponto Doença CD5 CD23 CD79b FMC7 sIg escores W (1) + + + + + LLC (escore) LPL-B HCL LCM LF LEZM -/w (1) + + + + + -/w (1) + +/- + + + + (1) +/- - + - - + (1) - -/+ +/- -/+ -/+ 4 - 5 0 - 1 0 - 1 1 - 2 0 - 1 0 - 1 CD79b - parte do receptor de antígeno da célula B; CD22 pode ser usado FMC7 - liga-se a um epitopo na conformação do CD20. CD20 de baixa intensidade na LLC, porém FMC7 é melhor para o sistema de escore Catovsky D. Hematol Oncol Clin N Am 2004; 18:783-794

  31. LINFOMA E LEUCEMIA DA CÉLULA T DO ADULTO O HTLV-1 pode ser transmitido sexualmente, transfusão sanguínea e aleitamento materno. A transmissão requer a transferência das células infectadas, não se transmitindo o vírus livre. • CARACTERÍSTICAS LABORATORIAIS DO ATCL: • Presença de anticorpos contra o HTVL - I • Fenótipo de células T monoclonais • Positivo para CD2, CD3, CD4, CD5 e CD25 • Negativo para TdT, CD7, CD8 e CD1 • Identificação da presença do genoma pró-viral do HTLV-I por Southern blotting ou PCR • Isolamento do vírus HTLV-1 • Hipercalcemia

  32. Linfoma/Leucemia da Célula T do Adulto: Células polilobuladas (flower cell) com citoplasma fracamente basofílico. A cromatina nuclear é pouco condensada, raramente nucléolos. O citoplasma é moderadamente basofílico. Na forma aguda é comum um grande número de linfócitos atípicos no S.P. e as células variam de tamanho e forma. Na forma crônica as células tumorais são uniformes em tamanho, tendo menor porcentual do que a forma aguda.

  33. LINFOMA NÃO - HODGKIN • gg linfáticos → adenomegalia • proliferação clonal T, B, cells retics • LNH-B são os mais freqüentes • sintomas B: 20% dos casos • freqüentemente extranodal

  34. AGENTES ETIOLÓGICOS • Predisposição individual • Imunodeficiência ou estimulação • Radiações ionizantes / subst tóxicas • Infecção viral • Alteração citogenética • Transplante de órgãos

  35. AGENTES INFECCIOSOSENVOLVIDOS COM OS LNH Burkitt ..................EBV e MALÁRIA L. T/NK nasal......Vírus Epstein-Barr L. MALT gástrico................H.pylori L. / Leucemia cel -T....HTLV-I (adulto)

  36. DIAGNÓSTICO CLÍNICO • Adenomegalia superficial ou • Cadeias ganglionares profundas • Hepato e esplenomegalia (freq) • Tumorações em outros órgãos e tecidos (ossos, pele, glândulas, SNC (extranodais)

  37. DIAGNÓSTICO CLÍNICO • Fraqueza, febre • Emagrecimento e palidez • Hemorragias não são freqüentes •  tumoral em ossos e nervos  sintomas neurológicos • Infiltração do tecido cutâneo

  38. HEMOGRAMA Citopenias: I.M.O. Leucocitose (LLBDD ~ LLC) Grandes células (leucossarcoma) BIÓPSIA GG Do maior gânglio Cervical e axilar Inguinal só se bem patológico MIELOGRAMA Pode ser normal Freqüente infiltração BIÓPSIA M.O. Células agrupadas (como nódulos normais) Infiltração pode ser de forma difusa no parênquima medular DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

  39. IMUNOFENOTIPAGEM • Citometria de Fluxo: SP,MO,gg • Clone de células B: • CD10, CD19, CD20,CD22, CD23 • Clone de células T: • CD2, CD3, CD5,CD7, CD4, CD8

  40. TRANSLOCAÇÕES CROMOSSÔMICASneoplasias de célula B NEOPLASIA Transloc. Gene Envolv. Conseq. Burkitt t(8;14) c-myc e IgH ativç c-myc MALT t(11;18) AP12 e mlt apoptose t(1;14) bcl-10 + agressiva FOLICULAR t(14;18) IgH e bcl-2 ativç bcl-2 MANTO t(11;14) bcl-1 e IgH ativç bcl-1/ciclD1 Gds Cells B Dif. t(3;14)→ bcl-6→Dça extranod. Melhor prog.

  41. TRANSLOCAÇÕES CROMOSSÔMICASneoplasias de célula T NEOPLASIA transloc. Gene Envolv. Conseq. L.linfoblástico t(1;14) tal-1/SCL transcrição e a-TCR hematopoiética LGC. Anaplásico t(2;5) ALK e NPM formação de tirosina-quinase NPM-ALK híbrida

  42. ESTADIAMENTO CLÍNICO • Tratamento, prognóstico, comparação • Hemograma, DHL, ß2-microglobulina • Sorologias: HTLV I e II, EBV • B.M.O., biópsia ganglionar • Diagnósticos por imagem • Cintilografia com Gálio

  43. ESTADIAMENTO CLÍNICO DE ANN ARBOR - 1971 • I: 1 região nodal (R.N.):(I); ou de 1 órgão ou local extra-nodal (EN): (IE). • II: 2 R.N., mesmo lado do diafragma (II) ou envolv. localizado de 1 órgão ou local E.N. e 1 ou + R.N. do mesmo lado do diafragma (IIE) • III: envolv. R.N. em ambos os lados do diafragma (III) que se podem acompanhar de lesão no baço (IIIS), de local E.N. (IIIE) ou ambos (IIISE). • IV: doença disseminada em um ou mais órgãos ou tecidos E.N., com ou sem ↑ de gg linfáticos.

  44. Índice Prognóstico Internacional A . Pacientes de todas as idades Risco Relativo IDADE < 60 anos x > 60 anos 1.96 DHL < normal x > normal 1.85 Estado Clínico 0.1 x 2-4 1.80 Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV 1.47 Envolvimento extra-nodal <1sítio x >1 1.48 B. Pacientes com menos de 60 anos Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV 2.17 DHL < normal x > normal 1.95 Estado Clínico 0.1 x 2-4 1.81

  45. CLASSIFICAÇÃO DOS LNH • Baseada na biópsia tecidual • Características imunológicas • Características citogenéticas - moleculares

  46. Freqüência dos LNH • LGCBD 30,6% • FOLICULAR 22,1% • Células B Z. Marginal, MALT 7,6% • Células T Periféricas 7,0% • Pequenos Linfócitos B 6,7% • Célula do Manto 6,0% • LGCB do mediastino 2,4% • Linfoblástico de cél T Precurs. 1,7% • lLinfoplasmocitóide 1,2% • Burkitt, Micose Fungóide < 1% • Outros tipos 6,1%

  47. LINFOMA DE GRANDES CÉLULAS B DIFUSO

  48. LGCB – CÉLULAS NÃO CLIVADAS

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