Real Time PCR

1. Real Time PCR 定量原理及操作 白巨利 2011.10.19

2. Poly(A)*尾 5’ 3’ AAAAAAAA mRNA T T T T mRNA AAAAAAAA Oligo(dT) AMV Reverse Transcriptase cDNA T T T T 3’ 5’ cDNA T T T T 3’ 5’ PCR扩增 …… RT-PCR原理及其应用 Kary B. Mullis（1944－）

3. PCR扩增 变性--退火--延伸三个步骤 • 模板DNA的变性：93℃-95℃左右， • 模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5 ℃ • 引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性

4. 1 2 3 高温变性 低温退火 适温延伸 94 温度 （℃） 72 55 22 1 2 3 4 5 时间（min） PCR扩增 重复1~3步 25~30轮 DNA变性 形成2条单链 目的DNA片段 扩增100万倍以上 子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋

5. PCR产物检测 传统定量方法都是终点检测法，即PCR快到达平台期进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。 实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，克服终点法检测过程中“平台效应”对结果的影响，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。 实时荧光定量PCR检测荧光图谱

6. 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链 DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 PCR循环 = 双链DNA = 染料 = 荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB

7. 实时定量PCR技术是PCR技术和荧光检测技术的结合实时定量PCR技术是PCR技术和荧光检测技术的结合 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控PCR反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。

8. 如何定量

9. 荧光实时定量PCR原理及其应用 PCR的理论方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：扩增物数量； X ：起始模板数量； Ev：扩增效率； n：扩增循环数

10. 几个概念

11. Slope -3.322 100%efficiency PCR efficiency =[10(-1/slope)]-1 Where slope=1/m 荧光实时定量PCR原理及其应用 Threshold 荧光超过本底，达到可检测水平时的临界数值, 即PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。 Ct threshold cycle，临界循环数 threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。 PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好。 Ct 值越小，模板DNA的起始拷贝数越多； Ct 值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。 Y=x×(1+ Ev)n LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)

12. 荧光实时定量PCR原理及其应用 CT Threshold Baseline 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。

13. 荧光实时定量PCR原理及其应用 PCR的理论方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数 实时检测法定量原理 在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比.如果利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，那只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev) LgN0=LgNT-n×LgE n=Ct

14. log N0 =-Ct logE+logN 荧光实时定量PCR原理及其应用 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较 • 标准曲线 • 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 • 计算待测样品的初始模板浓度 logN=log N0 +nlogE n=Ct

15. 软件自动生成的标准曲线 Interpolation of real time graphical data to standard curve

16. Real Time PCR 荧光标记

17. 荧光定量PCR标记方法 • 内掺式染料 • SYBR Green I • 序列特异性探针 • Taqman • Molecular Beacons • Dual Probes(FRET) • 引物特异性探针 • Amplifluor (Intergen)

18. SYBR-Green I 是一种dsDNA的内插染料，能插入到双链DNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与dsDNA的数量成正比。如SYBR GreenⅠ染料，当它没有结合上双链DNA时，只发出相对弱的荧光；然而，当它一旦插入到双链DNA里时，荧光信号将会强烈地增加，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。

19. 3’ 5’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 3’ 5’ SYBR-Green I

20. 3’ 5’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 3’ 5’ SYBR-Green I

21. 双标记探针（Taqman Probe） 5’端标记荧光分子（如：FAM），在3’端标记一个吸收或淬灭荧光的分子（如：TAMRA）， 这样5’端激发出的荧光会被3’端的分子淬灭或吸收掉，所以开始时，仪器并不能检测到荧光。由于Taq聚合酶同时具有5’端外切酶的活性，在PCR反应的延伸阶段，Taq酶会把5’端的荧光分子切下，使其与3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR产物扩增量的增加。

22. 3’ 5’ R Q Q R Excitation R Q R Q 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 双标记探针（Taqman Probe）

23. 分子信标（Molecular Beacon Probe） Real-time Chemistries 独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成，探针的5’端标记荧光分子，3’端 标记一个吸收或淬灭荧光的分子 。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5’端荧光分子与3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。

24. Excitation R Q Q Emission R Q R Excitation 分子信标（Molecular Beacon Probe） X

25. 荧光共振能量传递（FRET Probe） FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）探针是根据荧光能量共振传递原理设计的探针。设计两段探针，一个在3’端标记一种荧光分子，另一个在另一探针的5’端标记接收荧光的分子，当探针与模板没有杂交时5’端与3’端距离较远，共振能量传递很低；当探针与模板杂交上后， 5’端与3’端靠得很近，前者的荧光分子受激将能量传递到后者，从而激发3’端的荧光分子，使荧光信号强烈地增加,同样荧光信号的强度与模板量是成正比的；该种方法不仅可以做定量，也可以做基因型分析。

26. Transfer Excitation Emission 荧光共振能量传递（FRET Probe） Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640

27. Hybridisation probes Molecular Beacons TaqMan / Dual-labelled probes 各种检测的优缺点比较 Scorpions primers MGB Eclipse probes SYBR Green I

28. Fluorophores Excitation/Emission Filter-Setup 激发波长/检测波长 5-FAM, 6-FAM 495/520 FAM Channel JOE 520/548 JOE Channel TET 520/548 JOE Channel HEX 521/536 JOE Channel VIC 538 /554 JOE Channel Cy3 550/570 470/585 or 530/585 TAMRA 555/576 530/585 Cy3.5 581/596 ROX Channel ROX 575/602 ROX Channel Red 640 625/640 Cy5 Channel Cy5 649/670 Cy5 Channel 附表

29. RT-PCR操作流程 总RNA的提取及纯化 起始用量1-2 ug 28s 18s RNA电泳 RNA浓度及 纯度的测定 逆转录 定量 定性 荧光定量PCR检测 要求凝胶电泳为唯一的特异性条带

30. PCR 引物的设计 PCR引物设计软件：Primer premier, Oligo, Beacon design qRT-PCR引物序列参考的相关网站：RTPrimer DB/Primer Bank/Realtime PCR Primer Sets

31. 引物设计的原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。扩增产物最好为80-200bp，最大不要超过300bp。 2. 引物序列在模板内应当避免相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。 6. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 8. 引物的特异性要高，应进行blast避免非特异性的产物。

32. 探针设计的一般原则 • 扩增片段的长度不应太大,一般小于300bp • 探针不能和任一引物互补 • 探针保证特异性的前提下尽可能的短，长度不超过30bp • 探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度 • 探针应尽可能的靠近引物 • 如用于检测多态位点,多态位点应尽可能的靠近探针中部 • 探针5’端不能是G，G有淬灭作用

33. 实验过程中注意事项 • 裂解细胞时，应在冰上操作； • 提取及纯化RNA所用耗材全部都要去除Rnase，避免降解； • 反转录之前要进行RNA的一致化定量,反转录反应尽量均一化； • 定量PCR操作时，如果同一基因的样本数较多，可以采用预先配置混合液的办法加样，最大程度地减少加样操作误差； • 实验样本的重复，最少3个样本，每个样本3个复孔。

34. 实验方法的选择——相对定量 • 相对定量： 相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率，没有确切的数字被检测到，这种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法（⊿⊿Ct）”。该方法可以彻底不需要标准曲线，通过观察样品中目的基因与内参基因的相对变化，从而分析不同样品间目的基因初始模板数的相对变化量。 • 适用范围：目的及参照的动态范围应该相类似，即两个扩增子的反应效率大致相同。如果不同则应该用标准曲线来对基因表达进行定量，或优化反应使其获得一个类似的效率。 • 优缺点：优点是不需要做标准曲线，节约成本；缺点是要严格优化扩增效率（不同扩增子效率会对结果分析造成一定的影响，尤其变化倍数较大的情况下），每次PCR反应都必须做内参基因。 • 数据分析：fold=(1+E1)-⊿ Ct1• (1+E2)-⊿ Ct2 假定两个扩增子效率都为100%，则公式变为fold=2-⊿⊿Ct

35. 实验方法的选择——绝对定量 • 绝对定量： 绝对定量是指是将未知样品与标准品所制得的标准曲线相比较，从而得出未知样品的绝对初始模板数量。一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品。 • 适用范围：在有标准品存在的情况下，可以单独做任何目的基因的扩增。 • 优缺点：优点是定量准确性高，内参基因和目的基因可以单独做PCR扩增；缺点是成本较高，标准品费用昂贵。 • 数据分析：Quantity=Y• (1+E)-Ct 目的基因的表达变化=目的基因的表达量/内参基因表达量

36. 实验方法的选择——相对绝对定量 • 相对绝对定量： 相对绝对定量是指是将未知样品与假定的标准品所制得的标准曲线相比较，从而得出未知样品的相对对初始模板数量。假定标准品可以是一个cDNA样品或者PCR产物。 • 适用范围：需要自己制备标准品，PCR产物做标准品时要求产物特异性高，cDNA应选用与样本来源一致的cDNA产物。 • 优缺点：优点是定量准确性高，内参基因和目的基因可以单独做PCR，无需严格优化扩增效率；缺点是增加一定工作量，但与完全相对定量方法相比，也未必增加工作量。 • 数据分析：Quantity=Y• (1+E)-Ct 目的基因的表达变化=目的基因的表达量/内参基因表达量 所得结果也可以用相对定量方法进行分析

37. Thank you!