Aspects th oriques de la s paration chromatographique

1. Aspects théoriques de la séparation chromatographique Anne Mortier

2. ChromatographiePlace dans les laboratoires La chromatographie a pris une place considérable dans les laboratoires d’analyse depuis son invention il y a juste 100 ans . En terme de chiffre d’affaire mondial , la chromatographie représentait , en 2003, 41 % du marché de l’instrumentation d’analyse moléculaire.La chromatographie a pris une place considérable dans les laboratoires d’analyse depuis son invention il y a juste 100 ans . En terme de chiffre d’affaire mondial , la chromatographie représentait , en 2003, 41 % du marché de l’instrumentation d’analyse moléculaire.

3. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

4. ChromatographieHistorique 1906 : un chimiste russe, Mikhail Tswett, sépare des pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium pulvérulent, les pigments sont entraînés avec de l'éther de pétrole 1940 : Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952 1952: mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) 1968 : mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC en anglais 1979 : première séparation chirale par HPLC Il y a 100 ans et quelques mois, un chimiste russe découvrait la chromatographie en purifiant des pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de craieIl y a 100 ans et quelques mois, un chimiste russe découvrait la chromatographie en purifiant des pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de craie

5. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

6. Qu’est-ce que la chromatographie? Cette figure montre comment deux espèces A et B se séparent dans une colonne par le processus d’élution. Un échantillon contenant les 2 composés est introduit en tête de colonne.L’avancée graduelle du solvant, ajouté au sommet de la colonne, entraîne les solutés vers le bas de la colonne en une suite continue de transferts entre les deux phases, la PS tassée dans la colonne et la PM ou éluant qui la traverse.La vitesse de progression des deux composés dépend du temps qu’ils passent chacun dans la PS et dans la PM.Les différences de vitesse résultantes amènent la séparation des constituants du mélange sous forme de bandes tout au long de la colonne , bandes qui sortent individuellement en faisant passer un volume suffisant de PM dans cette colonne. Cette figure montre comment deux espèces A et B se séparent dans une colonne par le processus d’élution. Un échantillon contenant les 2 composés est introduit en tête de colonne.L’avancée graduelle du solvant, ajouté au sommet de la colonne, entraîne les solutés vers le bas de la colonne en une suite continue de transferts entre les deux phases, la PS tassée dans la colonne et la PM ou éluant qui la traverse.La vitesse de progression des deux composés dépend du temps qu’ils passent chacun dans la PS et dans la PM.Les différences de vitesse résultantes amènent la séparation des constituants du mélange sous forme de bandes tout au long de la colonne , bandes qui sortent individuellement en faisant passer un volume suffisant de PM dans cette colonne.

7. Chromatographiedéfinition Méthode de séparation des constituants d’un mélange reposant sur les équilibres de concentration qui apparaissent lorsqu’un composé est mis en présence de deux phases non miscibles La chromatographie est une technique de séparation des constituants d'un mélange basée sur les interactions entre trois partenaires lors d'un processus dynamique : le composant (produit contenu dans le mélange), la phase mobile (l’éluant) la phase stationnaire Elle repose sur les équilibres.... La chromatographie est une technique de séparation des constituants d'un mélange basée sur les interactions entre trois partenaires lors d'un processus dynamique : le composant (produit contenu dans le mélange), la phase mobile (l’éluant) la phase stationnaire Elle repose sur les équilibres....

8. ChromatographieAspects généraux Phase stationnaire (PS) : immobilisée dans une colonne ou fixée sur un support plan(ccm) Phase mobile (PM) : se déplaçant au contact de la première Elution : processus par lequel un composé est entraîné par le mouvement de la phase mobile à travers la phase stationnaire

9. ChromatographieAspects généraux Vitesse de la PM dans la colonne exprimée : en débit,D : volume de solvant traversant la colonne par unité de temps (mL/min) en vitesse linéaire,u : distance parcourue dans la colonne par unité de temps (cm/min)

10. ChromatographieAspects généraux chromatogramme

11. ChromatographieAspects généraux Chromatogramme : tracé des variations de composition de la phase éluée au cours du temps Si , en bout de colonne, on place un détecteur qui répond à la concentration du soluté,on obtient un graphique d’une fonction de la concentration en soluté en fonction du temps.c’est le chromatogramme.Si , en bout de colonne, on place un détecteur qui répond à la concentration du soluté,on obtient un graphique d’une fonction de la concentration en soluté en fonction du temps.c’est le chromatogramme.

12. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

13. Chromatographieclassification Selon le phénomène physique responsable des échanges entre PS et PM : adsorption partage échange d’ions exclusion affinité Selon le nature physique de la phase mobile : liquide gaz Selon l’objectif visé : chromatographie analytique chromatographie préparative Nous n’envisagerons ici que la chromatographie sur colonne; On peut classer les différentes chromatographies selon le type d’interaction avec la PS et la PM, selon le type d’équilibre( ces interactions seront abordées dans le deuxième exposé); selon la nature de la PM, liquide ou gazeuse, et enfin selon l’objectif poursuivi, chromatographie analytique ou chromatographie préparative. La chromatographie analytique constitue le thème de ces deux journées. Nous n’envisagerons ici que la chromatographie sur colonne; On peut classer les différentes chromatographies selon le type d’interaction avec la PS et la PM, selon le type d’équilibre( ces interactions seront abordées dans le deuxième exposé); selon la nature de la PM, liquide ou gazeuse, et enfin selon l’objectif poursuivi, chromatographie analytique ou chromatographie préparative. La chromatographie analytique constitue le thème de ces deux journées.

14. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

15. ChromatographieAppareillage

16. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

17. Chromatographiegrandeurs de rétention Temps de rétention Volume de rétention Coefficient de distribution Facteur de rétention

18. Chromatographiegrandeurs de rétention Temps de rétention: tR temps écoulé entre l’instant de l’injection et celui qui correspond sur le chromatogramme au maximum du pic qui lui est lié

19. Chromatographiegrandeurs de rétention Temps de rétention réduit : tR’ tR’= tR – tM tM ou t0 : temps mort : temps nécessaire pour qu’un composé non retenu traverse la colonne Le temps de rétention réduit est le temps de rétention diminué du temps mort, çad du temps nécessaire pour qu’une espèce non retenue traverse la colonne .L’échantillon contient souvent une telle espèce non retenue. Pour mesurer ce temps mort , on peut utiliser l’uracile sur une C 18 en HPLC, de l’air ou du méthane en GCLe temps de rétention réduit est le temps de rétention diminué du temps mort, çad du temps nécessaire pour qu’une espèce non retenue traverse la colonne .L’échantillon contient souvent une telle espèce non retenue. Pour mesurer ce temps mort , on peut utiliser l’uracile sur une C 18 en HPLC, de l’air ou du méthane en GC

20. Chromatographiegrandeurs de rétention Volume de rétention VR ou volume d’élution : Volume de phase mobile nécessaire pour faire migrer un composé d’un bout à l’autre de la colonne VR = tR . D D : débit de la phase mobile (constant)

21. Chromatographiegrandeurs de rétention Coefficient de distribution: KA rétention APM APS élution KA rapport entre la concentration du composé dans la phase stationnaire et la concentration du composé dans la phase mobile traduit l’importance relative des forces intermoléculaires qui existent entre le composé et les 2 phases Toutes les séparations chromatographiques sont basées sur les différences de répartition du soluté entre la PS et la PM. Cette équilibre est décrit par cette équation , caractérisée par une constante d’équilibre égale au rapport de la conc. du composé dans la PS à sa conc. dans la phase mobile. On parle aussi de rapport de distribution.Toutes les séparations chromatographiques sont basées sur les différences de répartition du soluté entre la PS et la PM. Cette équilibre est décrit par cette équation , caractérisée par une constante d’équilibre égale au rapport de la conc. du composé dans la PS à sa conc. dans la phase mobile. On parle aussi de rapport de distribution.

22. Chromatographiegrandeurs de rétention Facteur de rétention k’ ou k (ou de capacité) : Rend compte de la faculté plus ou moins grande de la colonne à retenir un composé Indépendant du débit de la PM et des dimensions de la colonne k’ est accessible à partir du chromatogramme Le facteur de rétention ou facteur de capacité, noté k’, est un paramètre expérimental important qui traduit l’affinité d’un composé pour la PS dans un système chromatographique.C’est le rapport entre le temps de rétention réduit et le temps mort; il est indépendant du débit de la PM et des dimensions de la colonne et est accessible à partir du chromatogramme. Le facteur de rétention ou facteur de capacité, noté k’, est un paramètre expérimental important qui traduit l’affinité d’un composé pour la PS dans un système chromatographique.C’est le rapport entre le temps de rétention réduit et le temps mort; il est indépendant du débit de la PM et des dimensions de la colonne et est accessible à partir du chromatogramme.

23. Chromatographiegrandeurs de rétention tR = tM + tR’ Si composé non retenu par la PS : tR = tM= tPM : temps passé dans la PM ? tR’= tPS: temps passé dans la PS si mT = mPM + mPS k’ est indépendant de mT Etant donné que le temps de rétention est une somme du temps mort et du temps de réduit et que pour un composé non retenue par la PS, le temps de rétention vaut le temps mort, çàd le temps passé dans la PM, et dans ce cas, le temps de rétention réduit est aussi le temps passé dans la PS. Le facteur de rétention correspond dès lors au rapport du temps passé par un composé dans la PS à celui passé dans la PM; Si une masse totale mt a été introduite dans la colonne (celle-ci se répartit en une masse mM présente dans la phase mobile et en une masse mS présente dans la PS.) Alors, les masses présentes dans chacune des phases sont proportionnelles aux temps passés dans chacune des phases. On trouve enfin que la facteur de rétention d’un composé est le produit de son coefficient de distribution multiplié par le rapport des volumes de PS et de PM respectivement. k’ est indépendant de la masse d’échantillon introduite dans le système chromatographique.Etant donné que le temps de rétention est une somme du temps mort et du temps de réduit et que pour un composé non retenue par la PS, le temps de rétention vaut le temps mort, çàd le temps passé dans la PM, et dans ce cas, le temps de rétention réduit est aussi le temps passé dans la PS. Le facteur de rétention correspond dès lors au rapport du temps passé par un composé dans la PS à celui passé dans la PM; Si une masse totale mt a été introduite dans la colonne (celle-ci se répartit en une masse mM présente dans la phase mobile et en une masse mS présente dans la PS.) Alors, les masses présentes dans chacune des phases sont proportionnelles aux temps passés dans chacune des phases. On trouve enfin que la facteur de rétention d’un composé est le produit de son coefficient de distribution multiplié par le rapport des volumes de PS et de PM respectivement. k’ est indépendant de la masse d’échantillon introduite dans le système chromatographique.

24. Chromatographiegrandeurs de rétention En chromatographie capillaire ( GC) : ß est très élevé ? tR réduits on peut prévoir le comportement des colonnes grâce à ce facteur ß : pour un composé et une PS donnés, k’ diminue quand ß augmente

25. Chromatographiegrandeurs de rétention Facteur de rétention k’ et tR : tR = tM ( 1 + k’ ) tR = tM( 1 + K / ß) ? permet de calculer le coefficient de distribution En pratique, k’ ne peut pas dépasser 10 k’ < 1: le composé sort trop tôt k’ ˜ 2-5 : correct On peut aussi établir le lien entre la valeur de k’ et le temps de rétention. Cette nouvelle relation permet de calculer le coefficient de distribution puisque la valeur de beta est accessible à partir des caractéristiques physiques de la colonne ( diamètre, épaisseur du film liquide déposé, longueur) En pratique, on veillera à garder des valeurs de k’ inférieur à 10 pour avoir une durée d’analyse raisonnable; Des valeurs comprises entre 2 et 5 sont des valeurs correctes.On peut aussi établir le lien entre la valeur de k’ et le temps de rétention. Cette nouvelle relation permet de calculer le coefficient de distribution puisque la valeur de beta est accessible à partir des caractéristiques physiques de la colonne ( diamètre, épaisseur du film liquide déposé, longueur) En pratique, on veillera à garder des valeurs de k’ inférieur à 10 pour avoir une durée d’analyse raisonnable; Des valeurs comprises entre 2 et 5 sont des valeurs correctes.

26. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

27. ChromatographieFacteur de séparation ou de sélectivité a permet de préciser les positions relatives de deux pics sur un chromatogramme : a est toujours supérieur à 1 a est l’aptitude d’un système chromatographique à séparer deux composés A partir de ces grandeurs de rétention, on peut définir le facteur de séparation alpha ( iupac) ou facteur de sélectivité qui permet de préciser les positions relatives de deux pics sur un chromatogramme. Ce facteur de séparation est le rapport du coefficient de distribution du composé le plus retenu à celui du composé le moins retenu. Il vaut aussi le rapport des facteur de rétention k’ de ces deux composés et est accessible sur le chromatogramme à partir des temps de rétention réduits. Une valeur de alpha supérieure à l’unité est la condition pour avoir une séparation de 2 composés par chromatographie. alpha représente la sélectivité çàd l’aptitude d’un système chromatographique à séparer deux composés. Plus la valeur de alpha est grande, plus les pics des composés en question sont éloignés l’un de l’autre.A partir de ces grandeurs de rétention, on peut définir le facteur de séparation alpha ( iupac) ou facteur de sélectivité qui permet de préciser les positions relatives de deux pics sur un chromatogramme. Ce facteur de séparation est le rapport du coefficient de distribution du composé le plus retenu à celui du composé le moins retenu. Il vaut aussi le rapport des facteur de rétention k’ de ces deux composés et est accessible sur le chromatogramme à partir des temps de rétention réduits. Une valeur de alpha supérieure à l’unité est la condition pour avoir une séparation de 2 composés par chromatographie. alpha représente la sélectivité çàd l’aptitude d’un système chromatographique à séparer deux composés. Plus la valeur de alpha est grande, plus les pics des composés en question sont éloignés l’un de l’autre.

28. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

29. Modèle des plateaux déplacement du soluté dans la colonne en une suite d’étapes distinctes à chaque étape: APM APS colonne de chromatographie = série de compartiments distincts ou « plateaux théoriques » dans lesquels s’établit l’équilibre de répartition du soluté chromatographie = suite de temps d’équilibration suivis de glissements de la PM d’un plateau par rapport à la PS Différentes théories ont été avancées pour modéliser la chromatographie. L’une de ces théories, le modèle des plateaux (de Craig), considère que chaque soluté se déplace progressivement dans la colonne en une suite d’étapes distinctes. A chacune de ces étapes, la concentration du soluté dans la PM est en équilibre avec la concentration du soluté dans la PS. On peut alors imaginer la colonne de chromatographie comme une série de compartiments distincts dans lesquels s’établit l’équilibre de répartition du soluté. Ces compartiments imaginaires  sont ce qu’on appelle les « plateaux théoriques ». A chaque nouvel équilibre , le soluté a progressé d’un petit disque supplémentaire dans la colonne. La chromatographie est décrite comme une suite de temps d’équilibration suivis de glissements de la PM d’un plateau par rapport à la PS. Différentes théories ont été avancées pour modéliser la chromatographie. L’une de ces théories, le modèle des plateaux (de Craig), considère que chaque soluté se déplace progressivement dans la colonne en une suite d’étapes distinctes. A chacune de ces étapes, la concentration du soluté dans la PM est en équilibre avec la concentration du soluté dans la PS. On peut alors imaginer la colonne de chromatographie comme une série de compartiments distincts dans lesquels s’établit l’équilibre de répartition du soluté. Ces compartiments imaginaires  sont ce qu’on appelle les « plateaux théoriques ». A chaque nouvel équilibre , le soluté a progressé d’un petit disque supplémentaire dans la colonne. La chromatographie est décrite comme une suite de temps d’équilibration suivis de glissements de la PM d’un plateau par rapport à la PS.

30. Modèle des plateaux pics d’élution gaussien Un soluté se déplaçant dans une colonne donne un signal d’allure gaussienne au moment de sa sortie au niveau du détecteur ? : écart-type w1/2 ou ? = 2.35 ? : largeur à mi-hauteur w ou wb : largeur à la base = 4 ?  Ce modèle permet de montrer que le soluté se répartit dans les plateaux successifs selon une courbe de gauss et qu’un soluté se déplaçant dans la colonne donne un pic d’allure gaussienne au moment de sa sortie au niveau du détecteur. Le pic est dès lors caractérisé par un écart-type s plus ou moins grand selon l’étalement du pic. La largeur à mi-hauteur symbolisée par w 1/2 ou delta ,vaut 2.35 s.Ce modèle permet de montrer que le soluté se répartit dans les plateaux successifs selon une courbe de gauss et qu’un soluté se déplaçant dans la colonne donne un pic d’allure gaussienne au moment de sa sortie au niveau du détecteur. Le pic est dès lors caractérisé par un écart-type s plus ou moins grand selon l’étalement du pic. La largeur à mi-hauteur symbolisée par w 1/2 ou delta ,vaut 2.35 s.

31. Modèle des plateaux La colonne de longueur L est découpée en N petits disques fictifs ou « plateaux théoriques » de même hauteur H : N = nombre de plateaux théoriques L en cm ? H en cm La longueur de la colonne, L, est ainsi découpée en N petits disques ou « plateaux théoriques » de même hauteur H. Dans chacun d’eux s’établit l’équilibre de répartition du soluté entre PS et PM. N est le nombre de plateaux théoriques de hauteur H. La hauteur d’un plateau théorique se mesure en cm. La longueur de la colonne, L, est ainsi découpée en N petits disques ou « plateaux théoriques » de même hauteur H. Dans chacun d’eux s’établit l’équilibre de répartition du soluté entre PS et PM. N est le nombre de plateaux théoriques de hauteur H. La hauteur d’un plateau théorique se mesure en cm.

32. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

33. ?l2 = H . l H : coefficient de proportionnalité entre la variance de la bande et la longueur parcourue H : HEPT = hauteur équivalente à un plateau théorique l : longueur parcourue Efficacité d’une colonneDéfinition de H Plus le temps de séjour dans la colonne augmente, plus le pic « s’étale »principalement à cause du phénomène de diffusion La dispersion linéaire sl croît avec la longueur parcourue et la variance de la bande est proportionnelle à la longueur parcourue dans la colonne H est le coefficient de proportionnalité entre la variance de la bande et la longueur parcourue. La hauteur de plateau est aussi appelée hauteur équivalente d’un plateau théorique. Plus H est faible, plus la dispersion est faible,plus l’étalement de la bande est réduit, plus le pic est étroit. Plus le temps de séjour dans la colonne augmente, plus le pic « s’étale »principalement à cause du phénomène de diffusion La dispersion linéaire sl croît avec la longueur parcourue et la variance de la bande est proportionnelle à la longueur parcourue dans la colonne H est le coefficient de proportionnalité entre la variance de la bande et la longueur parcourue. La hauteur de plateau est aussi appelée hauteur équivalente d’un plateau théorique. Plus H est faible, plus la dispersion est faible,plus l’étalement de la bande est réduit, plus le pic est étroit.

34. Efficacité d’une colonneDéfinition de H s2 en cm2 l en cm ? H en cm Valeurs de H: 0.1 à 1 mm en GC ~ 10 µm en HPLC On retrouve la même dimension en cm pour H que celle établie par la théorie des plateaux. Les valeurs usuelles de H sont de 1/10ème à 1 mm en GC Elles atteignent 10 microns en HPLC On retrouve la même dimension en cm pour H que celle établie par la théorie des plateaux. Les valeurs usuelles de H sont de 1/10ème à 1 mm en GC Elles atteignent 10 microns en HPLC

35. Efficacité d’une colonne Pour une colonne de longueur L, le nombre de plateaux théoriques vaut le rapport de la longueur L de la colonne sur la hauteur d’un plateau. H est aussi le coefficient de proportionnalité de la variance de la bande en fonction de la longueur parcourue lorsque cette longueur est la longueur totale de la colonne On peut évaluer N en mesurant Tr et l’écart-type du pic chromatographique puisque ces 2 paramètres sont dans le même rapport que L et sigma L. Pour une colonne de longueur L, le nombre de plateaux théoriques vaut le rapport de la longueur L de la colonne sur la hauteur d’un plateau. H est aussi le coefficient de proportionnalité de la variance de la bande en fonction de la longueur parcourue lorsque cette longueur est la longueur totale de la colonne On peut évaluer N en mesurant Tr et l’écart-type du pic chromatographique puisque ces 2 paramètres sont dans le même rapport que L et sigma L.

36. Efficacité d’une colonneévaluation quantitative N = mesure de l’efficacité d’une colonne si H ?? largeur de bande ? ? séparation ? Car s=Wb/4 N est mesurable sur un chromatogramme Si N est constant, la largeur d’un pic chromatographique augmente quand le temps de rétention augmente N , le nombre de plateaux théoriques, permet d’évaluer quantitativement l’efficacité d’une colonne. L’efficacité d’une colonne à séparer des constituants est améliorée quand la hauteur d’un plateau théorique diminue. N est mesurable sur un chromatogramme On préfèrera mesurer la largeur à la base du pic ,w, valant 4 s ou encore, mesurer la largeur à mi-hauteur, w1/2 ( à cause des fréquentes déformations à la base du pic) On notera qu’à efficacité égale, pour une colonne donnée, la largeur d’un pic chromatographique augmente lorsque le temps de séjour dans la colonne augmente.N , le nombre de plateaux théoriques, permet d’évaluer quantitativement l’efficacité d’une colonne. L’efficacité d’une colonne à séparer des constituants est améliorée quand la hauteur d’un plateau théorique diminue. N est mesurable sur un chromatogramme On préfèrera mesurer la largeur à la base du pic ,w, valant 4 s ou encore, mesurer la largeur à mi-hauteur, w1/2 ( à cause des fréquentes déformations à la base du pic) On notera qu’à efficacité égale, pour une colonne donnée, la largeur d’un pic chromatographique augmente lorsque le temps de séjour dans la colonne augmente.

37. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

38. Théorie de l’élargissement des bandes influence de la vitesse d’écoulement de la phase mobile la variance du pic (?2) est proportionnelle à H : quand H diminue, la largeur du pic diminue Équation de van Deemter : H = A + B/ u + C. u u = vitesse linéaire d’écoulement de la phase mobile A, B, C : constantes pour une colonne donnée et une PS donnée La variance du pic chromatographique est proportionnelle à H et quand H diminue, la largeur diminue. Dans ce que nous avons vu précédemment, la vitesse de la PM n’a pas encore été prise en compte dans les différentes expressions caractérisant l’efficacité de la séparation. L’influence de la vitesse de la PM a été mise en évidence par des chimistes hollandais ( Van Deemter et al. 1950) . Ils ont pu montrer que vers les faibles débits, H augmentait asymptotiquement tandis que vers des débits plus élevés, H augmentait linéairement. C’est la courbe expérimentale établie pour une colonne de GC remplie. L’équation de van Deemter donne une interprétation mathématique de la courbe. H (HEPT) est une somme de trois termes , A , B/u, C,u, ayant chacun une signification physique précise . Cette équation montre qu’il existe une débit optimal pour chaque colonne, correspondant au minimum de H, comme le prévoit la courbe représentant l’équation. Les 3 coefficients A,B et C sont reliés à des paramètres physico-chimiques, à la colonne et aux conditions opératoires. La variance du pic chromatographique est proportionnelle à H et quand H diminue, la largeur diminue. Dans ce que nous avons vu précédemment, la vitesse de la PM n’a pas encore été prise en compte dans les différentes expressions caractérisant l’efficacité de la séparation. L’influence de la vitesse de la PM a été mise en évidence par des chimistes hollandais ( Van Deemter et al. 1950) . Ils ont pu montrer que vers les faibles débits, H augmentait asymptotiquement tandis que vers des débits plus élevés, H augmentait linéairement. C’est la courbe expérimentale établie pour une colonne de GC remplie. L’équation de van Deemter donne une interprétation mathématique de la courbe. H (HEPT) est une somme de trois termes , A , B/u, C,u, ayant chacun une signification physique précise . Cette équation montre qu’il existe une débit optimal pour chaque colonne, correspondant au minimum de H, comme le prévoit la courbe représentant l’équation. Les 3 coefficients A,B et C sont reliés à des paramètres physico-chimiques, à la colonne et aux conditions opératoires.

39. Théorie de l’élargissement des bandesEquation de van Deemter A: diffusion turbulente ou diffusion de Eddy : terme dû aux multiples veines d’écoulement : A= ?.dp ? : facteur de remplissage de la colonne dp : diamètre des grains Le terme A , appelé diffusion turbulente ou diffusion d’Eddy, est relié au profil d’écoulement de la PM à travers la PS. La taille des particules, leur répartition et la régularité du remplissage de la colonne sont à l’origine de chemins préférentiels de la PM et donc du soluté qu’elle transporte, chemins ou trajectoires qui ont des longueurs différentes. Ce phénomène contribue à élargir le pic chromatographique comme on peut l’imaginer par le schéma qui suit.Le terme A , appelé diffusion turbulente ou diffusion d’Eddy, est relié au profil d’écoulement de la PM à travers la PS. La taille des particules, leur répartition et la régularité du remplissage de la colonne sont à l’origine de chemins préférentiels de la PM et donc du soluté qu’elle transporte, chemins ou trajectoires qui ont des longueurs différentes. Ce phénomène contribue à élargir le pic chromatographique comme on peut l’imaginer par le schéma qui suit.

40. Théorie de l’élargissement des bandesEquation de van Deemter Diffusion de Eddy Une phase stationnaire de granulométrie fine et régulière diminue le terme A.Une phase stationnaire de granulométrie fine et régulière diminue le terme A.

41. Théorie de l’élargissement des bandesEquation de van Deemter Colonne pleine : A ? 0 Colonne capillaire(G.C.) : A = 0 ? Equation de Golay pour la GC en colonne capillaire : Ce terme A est absent par nature dans les colonnes capillaires car il n’y a pas de remplissage de la colonne. L’équation sans terme A est l’équation de Golay et la courbe coorespondante montre l’abaissement de la courbe consécutif à la supression du terme A.Ce terme A est absent par nature dans les colonnes capillaires car il n’y a pas de remplissage de la colonne. L’équation sans terme A est l’équation de Golay et la courbe coorespondante montre l’abaissement de la courbe consécutif à la supression du terme A.

42. Théorie de l’élargissement des bandesEquation de van Deemter B/u : diffusion longitudinale : diffusion du composé de la région concentrée d’une bande vers la région diluée ? : facteur d’obstruction ou de tortuosité DM : coefficient de diffusion : mesure la mobilité du composé dans la phase mobile plus faible dans les liquides que dans les gaz augmente avec la température diminue quand la viscosité du milieu augmente

43. C.u : cinétique de transfert de masse C. u = (CPS + CPM).u Transfert de masse favorisé par : une faible épaisseur de phase stationnaire un petit diamètre de colonne une température plus élevée un coefficient de diffusion DM peu élevé (PM peu visqueuse) un faible débit d’éluant Théorie de l’élargissement des bandesEquation de van Deemter Le terme Cu est la cinétique de transfert de masse ou cinétique d’échange entre PM et PS. On observe aussi un élargissement des pics dû aux effets de transfert de masse. L’équilibre entre PM et PS s’établit lentement et la qualité de la séparation sera mauvaise si l’élution est trop rapide et les équilibres, incomplets ce qui se produit aux grandes valeurs de u Ce transfert de masse est dès lors favorisé par de faibles épaisseurs de PM et de PS, par un petit diamètre de colonne, par des coefficients de diffusion élevés ( PM peu visqueuse ), par des débits d’éluant faibles. On constate donc que la contribution de la vitesse d’élution sur les termes B/u et C.u est contradictoire. La courbe expérimentale montre qu’il faut chercher un compromis entre deux phénomènes : la diffusion et la vitesse d’échange entre les phases.Le terme Cu est la cinétique de transfert de masse ou cinétique d’échange entre PM et PS. On observe aussi un élargissement des pics dû aux effets de transfert de masse. L’équilibre entre PM et PS s’établit lentement et la qualité de la séparation sera mauvaise si l’élution est trop rapide et les équilibres, incomplets ce qui se produit aux grandes valeurs de u Ce transfert de masse est dès lors favorisé par de faibles épaisseurs de PM et de PS, par un petit diamètre de colonne, par des coefficients de diffusion élevés ( PM peu visqueuse ), par des débits d’éluant faibles. On constate donc que la contribution de la vitesse d’élution sur les termes B/u et C.u est contradictoire. La courbe expérimentale montre qu’il faut chercher un compromis entre deux phénomènes : la diffusion et la vitesse d’échange entre les phases.

44. Théorie de l’élargissement des bandesEquation de van Deemter En HPLC : effet moins prononcé de B/U à très faible débit car DM beaucoup plus faible qu’en GC La contribution du terme C.u sur H dépend de la vitesse de l’éluant de manière plus complexe Voici la courbe de Van Deemter pour l’HPLC/ On n’observe pas de remontée abrupte de la courbe du côté des très faibles débits car le coefficient Dm est beaucoup plus faible qu’en GC La contribution du terme C.u sur H dépend de la vitesse de l’éluant de manière plus complexe car la cinétique de transfert de masse dans la Pm liquide est très limitéeVoici la courbe de Van Deemter pour l’HPLC/ On n’observe pas de remontée abrupte de la courbe du côté des très faibles débits car le coefficient Dm est beaucoup plus faible qu’en GC La contribution du terme C.u sur H dépend de la vitesse de l’éluant de manière plus complexe car la cinétique de transfert de masse dans la Pm liquide est très limitée

45. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

46. Qualité d’une séparation Deux facteurs contribuent à une bonne séparation par chromatographie : la différence entre les temps de rétention la largeur des pics Examinons à présent les conditions pour avoir une bonne séparation de deux pics chromatographiques. On le voit sur le schéma, une séparation efficace requière une différence suffisante entre les tr et une largeur de pic restreinte.Examinons à présent les conditions pour avoir une bonne séparation de deux pics chromatographiques. On le voit sur le schéma, une séparation efficace requière une différence suffisante entre les tr et une largeur de pic restreinte.

47. Résolution La résolution est la qualité de séparation de deux pics voisins. Pour deux molécules A et B : W b = 4 ?  Ceci nous amène à définir la résolution qui est le degré de séparation de deux pics voisins ou la qualité de séparation de deux pis voisins. Elle est mesurée par la différence des tr rapportée à la moyenne arithmétique des largeurs à la base des picsCeci nous amène à définir la résolution qui est le degré de séparation de deux pics voisins ou la qualité de séparation de deux pis voisins. Elle est mesurée par la différence des tr rapportée à la moyenne arithmétique des largeurs à la base des pics

48. Résolution Normalement, des pics voisins ont des ? pratiquement identiques. On trouve alors que : Comme des pics voisins ont vraisemblablement des largeurs identiques, la relation devient celle-ci.Comme des pics voisins ont vraisemblablement des largeurs identiques, la relation devient celle-ci.

49. Résolution RS = 1 si ?tR = 4s Une résolution de 1.5 est nécessaire pour une analyse quantitative (? tR = 6s) Si la différence entre les tr est de 4 sigmas, la résolution vaut 1. Pour une résolution de 1, le taux de recouvrement du pic de A par le pic de B et vice-versa est de 2,25%( car la surface comprise entre tr - 2? et tr + 2? est de 95,5%). Une séparation analytique demande une résolution de 1,5 çàd une différence de tr de 6 sigmas.Si la différence entre les tr est de 4 sigmas, la résolution vaut 1. Pour une résolution de 1, le taux de recouvrement du pic de A par le pic de B et vice-versa est de 2,25%( car la surface comprise entre tr - 2? et tr + 2? est de 95,5%). Une séparation analytique demande une résolution de 1,5 çàd une différence de tr de 6 sigmas.

50. Effet des facteurs de capacité et de sélectivité sur la résolution k’= facteur de capacité moyen de deux composés Quand a tend vers 1 On établit facilement la relation qui lie la résolution d’une colonne et le nombre de ses plateaux théoriques ainsi que les facteurs de rétention et de séparation de 2 composés.On établit facilement la relation qui lie la résolution d’une colonne et le nombre de ses plateaux théoriques ainsi que les facteurs de rétention et de séparation de 2 composés.

51. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? But : obtenir le degré de résolution souhaité en un minimum de temps augmenter N modifier k’ augmenter a L’ analyse de la courbe de Van Deemter nous a permis de voir comment améliorer les performances d’une analyse chromatographique en agissant sur H. Lorsqu’on souhaite optimiser une analyse, la résolution et le temps d’élution sont les deux variables dépendantes les plus importantes à optimiser; le but est de réussir une séparation suffisante en un minimum de temps. En reprenant la formule de la résolution, on constate qu’on peut l’améliorer en agissant sur trois paramètres :l’efficacité,le facteur de rétention et la sélectivité. Résumons les facteurs influençant favorablement ces trois paramètres , en gardant à l’esprit qu’il est toujours plus facile et moins hasardeux de modifier la physique que la chimie de la séparation.L’ analyse de la courbe de Van Deemter nous a permis de voir comment améliorer les performances d’une analyse chromatographique en agissant sur H. Lorsqu’on souhaite optimiser une analyse, la résolution et le temps d’élution sont les deux variables dépendantes les plus importantes à optimiser; le but est de réussir une séparation suffisante en un minimum de temps. En reprenant la formule de la résolution, on constate qu’on peut l’améliorer en agissant sur trois paramètres :l’efficacité,le facteur de rétention et la sélectivité. Résumons les facteurs influençant favorablement ces trois paramètres , en gardant à l’esprit qu’il est toujours plus facile et moins hasardeux de modifier la physique que la chimie de la séparation.

52. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? But : obtenir le degré de résolution souhaité en un minimum de temps augmenter N : ? L : si L doublée, alors R augmente de v2 mais durée de séparation augmente ? H : ?Ø particules support (?terme A ) ?Ø colonne (? terme C) ?T°(GC) (? terme B) ? épaisseur du film liquide(GC) (? terme C) ? viscosité de la PM ( HPLC) (? terme C) optimiser u ( vitesse linéaire de PM)

53. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? modifier k’: k’B optimum: 1-5 éviter k’B >10 (durée d’élution ! ) modifier la T° (GC) modifier la composition de la PM (HPLC) diminuer l’épaisseur du film liquide et augmenter le diamètre interne de la colonne (modification de ? en GC) augmenter a si proche de 1 (maintenir 1< k’< 10) modifier la T° de la colonne modifier la composition de la PS modifier la composition de la PM (HPLC) K’ supérieur à 10 : augmentation de la durée d’élution sans augmentation significative de la résolution Les facteurs k’ et alpha sont étroitement liés.K’ supérieur à 10 : augmentation de la durée d’élution sans augmentation significative de la résolution Les facteurs k’ et alpha sont étroitement liés.

54. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? Modification de k’ en cours d’élution : Par un gradient de composition ou programmation de solvant : augmentation graduelle ou continue de la puissance de l’éluant en cours d’élution (HPLC) Modification de k’, a et de H Amélioration de N et de R Par une programmation de température : augmentation graduelle ou continue de la température de la colonne en cours d’élution (GC) Modification de k’, a et de H Amélioration de N et de R Quand le mélange à séparer est complexe et que les coefficients de distributions et les facteurs de rétention sont très éloignés, on modifie k’ au cours -même de l’élution:par un gradient d’élution en HPLC ou par une programmation de température en GC.Quand le mélange à séparer est complexe et que les coefficients de distributions et les facteurs de rétention sont très éloignés, on modifie k’ au cours -même de l’élution:par un gradient d’élution en HPLC ou par une programmation de température en GC.

55. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? Programmation de température en GC

56. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

57. Comment réduire la diffusion hors colonne? Diffusion dans l’injecteur Diffusion dans le détecteur s2global= s2colonne+ s2injecteur + s2détecteur Variance du pic due à l’injection ou à la détection : Solutions : ? minimiser les volumes morts (« tubing ») ? détection « sur colonne », injection sur colonne (G.C.) Nous avons vu les phénomènes de diffusion dans la colonne, phénomènes qui contribuent à l’élargissement des pics. Mais une diffusion du soluté a également lieu en dehors de la colonne, dans l’injecteur , dans le détecteur et dans tous les éléments de jonction entre les différentes parties du système. La variance du pic due à l’injection ou à la détection est proportionnelle au carré du temps passé dans ces éléments . Pour la réduire, il convient de minimiser tous les volumes morts en réduisant au maximum la longueur des tubulures . Une détection sur colonne apporte l’avantage de supprimer la diffusion dans le détecteur.Nous avons vu les phénomènes de diffusion dans la colonne, phénomènes qui contribuent à l’élargissement des pics. Mais une diffusion du soluté a également lieu en dehors de la colonne, dans l’injecteur , dans le détecteur et dans tous les éléments de jonction entre les différentes parties du système. La variance du pic due à l’injection ou à la détection est proportionnelle au carré du temps passé dans ces éléments . Pour la réduire, il convient de minimiser tous les volumes morts en réduisant au maximum la longueur des tubulures . Une détection sur colonne apporte l’avantage de supprimer la diffusion dans le détecteur.

58. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

59. Pics asymétriques? pic gaussien ? K = CS/CM indépendant de la concentration en composé dans la colonne pic asymétrique si K varie avec la concentration en soluté Les chromatogrammes réels sont quelquefois loin de présenter des pics d’aspect gaussien. On ne peut observer un pic gaussien que si le coefficient de distribution est constant et indépendant de la concentration en soluté dans la colonne. On observera une déformation du pic par rapport à la courbe gaussienne quand ce coefficient de distribution varie avec la concentration dans la colonne. Les chromatogrammes réels sont quelquefois loin de présenter des pics d’aspect gaussien. On ne peut observer un pic gaussien que si le coefficient de distribution est constant et indépendant de la concentration en soluté dans la colonne. On observera une déformation du pic par rapport à la courbe gaussienne quand ce coefficient de distribution varie avec la concentration dans la colonne.

60. Pics asymétriques ? Fronting ou front diffus: la phase stationnaire est saturée Tailing ou traînée : de petites concentrations en soluté sont davantage retenues que des plus grandes concentrations Un isotherme de distribution est le graphique de la variation de la conc. ds la phase stationnaire en fonction de la concentration dans la phase mobile. Si cet isotherme est convexe, on parle de front diffus ou fronting, indiquant que la phase stationnaire est saturée en soluté Si l’isotherme est concave , on parle de traînée ou tailing. De petites concentrations en soluté sont davantage retenues que des plus grandes concentrations; ceci peut se produire lorsque des sites polaires du support de la PS ou de la paroi de la colonne en GC formant des liaisons avec les solutés polaires ( ex : diatomite, verre, silice). Un isotherme de distribution est le graphique de la variation de la conc. ds la phase stationnaire en fonction de la concentration dans la phase mobile. Si cet isotherme est convexe, on parle de front diffus ou fronting, indiquant que la phase stationnaire est saturée en soluté Si l’isotherme est concave , on parle de traînée ou tailing. De petites concentrations en soluté sont davantage retenues que des plus grandes concentrations; ceci peut se produire lorsque des sites polaires du support de la PS ou de la paroi de la colonne en GC formant des liaisons avec les solutés polaires ( ex : diatomite, verre, silice).

61. Pics asymétriques L’asymétrie d’un pic est traduite par deux paramètres : le facteur de traînée ou tailing factor (Ft ou TF) L’asymétrie d’un pic est traduite par deux paramètres appelés facteur de traînée et facteur d’asymétrie Le premier est le tailing factor (est souvent utilisé dans l’industrie pharmaceutique). Il est mesuré par le rapport AB sur AC , grandeurs mesurées à 5 % de la hauteur du pic.L’asymétrie d’un pic est traduite par deux paramètres appelés facteur de traînée et facteur d’asymétrie Le premier est le tailing factor (est souvent utilisé dans l’industrie pharmaceutique). Il est mesuré par le rapport AB sur AC , grandeurs mesurées à 5 % de la hauteur du pic.

62. Pics asymétriques le facteur d’asymétrie ou asymmetry factor (Fa ou As) Valeurs normales: entre 1.0 et 1.5 pour une nouvelle colonne Valeurs un peu plus élevées dans des conditions réelles L’asymmetry factor est plutôt utilisé dans l’industrie non pharmaceutique. Il est mesuré par le rapport BC sur AB , grandeurs mesurées à 10 % de la hauteur du pic. Les grandeurs seront du même ordre de grandeur mais seront rarement équivalentes. Les valeurs normales se situent entre 1 et 1.5 pour une nouvelle colonne et dans les conditions de test. Elles sont souvent légèrement supérieurs dans les conditions réelles d’utilisation d’une colonne.L’asymmetry factor est plutôt utilisé dans l’industrie non pharmaceutique. Il est mesuré par le rapport BC sur AB , grandeurs mesurées à 10 % de la hauteur du pic. Les grandeurs seront du même ordre de grandeur mais seront rarement équivalentes. Les valeurs normales se situent entre 1 et 1.5 pour une nouvelle colonne et dans les conditions de test. Elles sont souvent légèrement supérieurs dans les conditions réelles d’utilisation d’une colonne.

63. Pics asymétriques ? Fronting ou front diffus: Ft <1 Fa<1 Tailing ou traînée: Ft >1 Fa>1 Dans le cas d’un fronting, ces 2 paramètres sont inférieurs à l’unité. Dans le cas d’un tailing, les 2 paramètres sont supérieur à l’unité.Dans le cas d’un fronting, ces 2 paramètres sont inférieurs à l’unité. Dans le cas d’un tailing, les 2 paramètres sont supérieur à l’unité.

64. Plan général Historique Définition – Aspects généraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rétention Facteur de séparation Modèle des plateaux Efficacité d’une colonne Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter) Qualité d’une séparation - Résolution Diffusion hors colonne Pics asymétriques Dégradation d’une colonne

65. Dégradation d’une colonne? Suivi de la performance d’une colonne : Facteur de rétention d’un standard (k’) Nombre de plateaux (N) Asymétrie des pics

66. En conclusion.... Efficacité d’un chimiste analyste? En routine : « Do things in the right way  » rendement, productivité, économie augmenter le potentiel de l’utilisateur et de l’instrument En recherche : «  Do the right things » résolution de problèmes analytiques complexes réaction optimale et rapide à de nouvelles situations Si vous travaillez en routine, le mot d’ordre est do the things in the right way, çàd qu’on attend de vous rendement,productivité et économie. Ces deux journées vous permettront nous l’espérons d’augmenter votre potentiel d’utilisateur ainsi que celui de l’instrument! En recherche, le mot d’ordre est plutôt do the right things çàd qu’on attend de vous la résolution de problèmes analytiques complexes. Dans ce cas,peut-être vous aiderons-ns à avoir encore une réaction optimale et rapide face à de nouvelles situations? Si vous travaillez en routine, le mot d’ordre est do the things in the right way, çàd qu’on attend de vous rendement,productivité et économie. Ces deux journées vous permettront nous l’espérons d’augmenter votre potentiel d’utilisateur ainsi que celui de l’instrument! En recherche, le mot d’ordre est plutôt do the right things çàd qu’on attend de vous la résolution de problèmes analytiques complexes. Dans ce cas,peut-être vous aiderons-ns à avoir encore une réaction optimale et rapide face à de nouvelles situations?

67. Merci de votre attention! Références utiles: " Principes d'analyse instrumentale" Skoog, Holler, Nieman, De Boeck 2003. "Quantitative Chemical Analysis", D.C. Harris, Freeman, 6th Edition, 2003. "  Practical problem solving un HPLC"  , S. Kromidas, WILEY-VCH, 2005