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第 10 章 酶动力学

第 10 章 酶动力学. Michaelis 与 Menten 發展出酶动力学. Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.258. Michaelis. Menten. 转化 酶 Invertase (IT). HOCH 2. HOCH 2. HOCH 2. HOCH 2. 6. 1. HOCH 2. HOCH 2. 6. 5. 2. 5. 1. 2. 3. 4. 1. OH. 4. OH. OH. 2. O. O. HO. 3.

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第 10 章 酶动力学

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Presentation Transcript

  1. 第10章 酶动力学

  2. Michaelis 与 Menten 發展出酶动力学 Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.258 Michaelis Menten

  3. 转化酶Invertase (IT) HOCH2 HOCH2 HOCH2 HOCH2 6 1 HOCH2 HOCH2 6 5 2 5 1 2 3 4 1 OH 4 OH OH 2 O O HO 3 O O O O CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH H2C-OH C=O HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH HOCH2 HOCH2 HOCH2 O 还原糖 Reducing Power 非还原糖 IT Sucrose Fructose Glucose + b b H2O 1 2 3 4 5 6 Juang RH (2004) BCbasics

  4. 提高基质浓度增強酶活性表現 0 1 2 3 4 5 6 7 8 80 60 40 20 0 生 成 物 浓 度 0 2 4 6 8 基质浓度 mmole S + E ↓ P (在固定時間內反应) Juang RH (2004) BCbasics

  5. 酶动力学的基本出發點 E S Steady State Theory E E + + P S ES 的生成量与消失量相等， 故平衡時 [ES] 浓度成一穩定狀態。 Juang RH (2004) BCbasics

  6. 酶动力学大綱 – 緣起 Vmax[S] vo= k1 k3 Km+[S] E + S ES E + P (vo) k2 [Et]=[Ef]+[ES] vo = k3 [ES] Vmax = k3 [Et] 3.1 3.2 酶必須先与基质結合 Steady State [ES] 浓度恆定 3.2.1 ES 的生成量 等于其消失量 k1[E][S] = k2 [ES] + k3 [ES] 由上式出發可推得 Michaelis-Menten 公式 3.2.2 Juang RH (2004) BCbasics

  7. 酶动力学基本观察 E + S ES E + P k1 k3 (vo) k2 k1[E][S] = k2[ES] + k3[ES] (I) [Et] = [Ef] + [ES] (II) vo = k3[ES] (III) Vmax = k3[Et] (IV) Juang RH (2004) BCbasics

  8. (1) 整理 (I) 可得： (k2＋k3) [ES] = k1 [E][S] 移出 [ES] 定義 Km k1k2＋k3 [E][S] 故 [ES] = ─── [E][S]；另設 ───＝ Km則 [ES] = ─── k2＋k3 k1 Km vovo[E][S] k3 [E][S] (2) 由 (III) 得 [ES] = ─，故 ─ ＝ ─── 即 vo ＝ ──── (V) k3 k3 Km Km 由 [ES] 導入vo (3) 由 (II) 得 [Ef] ＝ [Et] - [ES]， 而 [Ef] 可視為 [E]，故： [E] ＝ [Et] - [ES] 代入 (V) 得︰ 分解 [E] k3 ([Et]-[ES])[S] k3 [Et][S] - k3 [ES][S] vo ＝ ─────── ＝ ───────── Km Km 转换得 Vmax 及 vo (4) 把 (III) vo ＝ k3 [ES] 及 (IV) Vmax ＝ k3 [Et] 代入得︰ Vmax [S] - vo [S] vo ＝ ─────── → vo Km ＝ Vmax [S] - vo [S] 移項 Km → vo Km + vo [S] ＝ Vmax [S] (VI) Juang RH (2004) BCbasics Vmax [S] (5) 整理 (VI) 集中 vo 即得 M-M 公式： vo ＝ ──── Km + [S] 提出 vo

  9. 动力学实验操作 (invertase) 1 vo vo 1 Vmax - 1 Km 1/S S 1)先取固定量的酶(invertase) →E 2)加入各种不同浓度的基质(蔗糖)→S(x 軸) 3)在一定時間 內測生成物量 (P/t)→vo(y 軸) 4)(x, y)作图得双曲線 之一股推漸近點→Vmax 5)當y = 1/2 Vmax時求其x (即 [S]) 即得→Km Vmax 1/2 Juang RH (2004) BCbasics Km 双倒數作图 直接作图

  10. 动力学实验操作实例 基质浓度 反应呈色 反应速率 双倒數 2.0 1.0 0 1.0 0.5 0 v 1/v 1.0 -3.8 -4 -2 0 2 4 0 1 2 [S] 1/[S] 实 驗 數 據 v (mmole/min) [S] 吸光值 1/S 1/v 編號 0.25 0.50 1.0 2.0 0.21 0.36 0.40 0.46 0.42 0.72 0.80 0.92 4 2 1 0.5 2.08 1.56 1.35 1.16 1 2 3 4 → → → → (1) 已知反应後呈色的吸光值每 0.05 吸光有 1 mmole 生成物。 (2) 酶催化反应的時間為 10 min。 双 倒 數 作 图 直 接 作 图 Juang RH (2004) BCbasics

  11. 酶的抑制 可逆性抑制 不可逆抑制 抑制剂与酶非共价結合 抑制剂与酶行共价性修飾 Penicillin 青黴素 Competitive 重金属 (Hg, Pb) Non-competitive DFP, TPCK Sarin (-Ser) PCMB (-Cys) (Mixed inhibition) Uncompetitive Juang RH (2004) BCbasics

  12. 酶的抑制 (機制) E + S→ES→E + P + I ↓ EI E + S→ES→E + P + + II ↓ ↓ EI+S→EIS E + S→ES→E + P + I ↓ EIS ← ← ← ↑ ↑ ↑ ↑ Uncompetitive Competitive Non-competitive E 基 质 E X 图 解 竞争結合區 另一結合區 抑制剂 抑 制 基 理 及 說 明 [I] 只与自由的 [E] 結合， 會与 [S] 竞争； [S]↑可克服 [I] 的抑制。 [I] 可与自由的 [E] 或已佔據 有 [S] 的 [ES] 結合， [S]↑不能克服 [I] 的抑制。 [I] 只能与 [ES] 結合， [S]↑反而有利 [I] 的抑制。 Juang RH (2004) BCbasics

  13. 酶的抑制 (作图) Uncompetitive Competitive Non-competitive Vmax Vmax vo Vmax’ Vmax’ 直 接 作 图 I Km [S], mM Km’ Km [S], mM 1/vo 1/vo 1/vo I 雙 倒 數 作 图 I 兩條平行線 交 於 X 軸 交於 Y 軸 1/Vmax 1/Vmax 1/Vmax 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S] Vmax vo I I Km Km’ [S], mM =Km’ Vmax不变；Km变大 Vmax变小；Km不变 Vmax及 Km均变小 I Juang RH (2004) BCbasics

  14. 思考与练习 • 1/v对1/[S]的双倒数作图得到的直线斜率为1.2×10-3min，在1/v轴上的截距为2.0×10-2ml.min/ n mol。计算Vmax和Km。 • 一个二肽酶对二肽Ala-Gly和二肽Leu-Gly的Km分别为2.8×10-4和3.5×10-2，哪一个二肽是酶的最适底物？该酶的两个非竞争性抑制剂的Ki值分别为5.7×10-2和2.6×10-4。哪一个是最强的抑制剂？ • 根据米式方程求（a）Kcat为30s-1，Km为0.005M的酶，在底物浓度为多少时，酶促反应的速度为1/4 Vmax？（b）底物浓度为1/2Km，2 Km和10 Km时，酶促反应的速率分别相当于多少Vmax？

  15. 4.枯草杆菌蛋白酶(相对分子质量27 600)是一种能催化某些氨基酸酯和酰胺水解的细菌蛋白酶。对于合成的底物N—乙酰—L—酪氨酸乙酯(Ac-Tyr-OEt)，枯草杆菌蛋白酶的Km和kcat分别为0．15mol／L和550 s-1。 (a)当枯草杆菌蛋白酶的浓度是0．40g／L时，Ac-Tyr—OEt水解的Vmax是多少? (b)吲哚是枯草杆菌蛋白酶的竞争性抑制剂，抑制剂常数Ki为0．05mol／L。当吲哚为6．25mmol／L时，计算Ac—Tyr-OEt被0．40g／L枯草杆菌蛋白酶水解的Vmax。 (c)计算0．40g／L枯草杆菌蛋白酶与0.25mol／L Ac—Tyr-OEt和1.0mol/L吲哚共同存在时的V。

  16. 5.红细胞中的碳酸酐酶(相对分子质量为30 000)具有很高的转换数。它催化C02的可逆水合反应： 此反应对CO2从组织运往肺部很重要。如果l0μg的纯碳酸酐酶在37℃下lmin内，以最大速度可催化0．3g CO2的水合反应，那么碳酸酐酶的转换数(Kcat)是多少

  17. 6. 酶溶液加热时，随着时间的推移，酶的催化活性逐渐丧失。这是由于加热导致天然酶的构象去折叠。己糖激酶溶液维持在45℃12分钟后，活性丧失百分之五十。但是若己糖激酶与大量的底物葡萄糖共同维持在 45℃12分钟，则活性丧失仅为3％。请解释，为什么在有底物存在下，己糖激酶的热变性会受到抑制？ 7.新掰下的玉米的甜味是由于玉米粒中的糖浓度高。可是掰下的玉米贮存几天后就不那么甜了，因为50％糖已经转化为淀粉了。如果将新鲜玉米去掉外皮后浸入沸水几分钟，然后于冷水中冷却，储存在冰箱中可保持其甜味。这是什么道理？

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