A Expressão de Colágeno VI durante o desenvolvimento do coração de Zebrafish ( Danio rerio )

1. A Expressão de Colágeno VI durante o desenvolvimento do coração de Zebrafish (Danio rerio) Aluno: Deivid Augusto da Silva Orientador: Gregory Thomas Kitten Laboratório do Desenvolvimento e Matriz Extracelular ICB – UFMG Dezembro - 2005

2. Estrutura • Importância do Zebrafish como modelo • Colágeno VI • Desenvolvimento do coração • Resultados • Discussão

3. Vantagens do Zebrafish como modelo • Ovos transparentes • Fertilização externa • Desenvolvimento rápido • Alta fecundidade • Pequeno tamanho – Não necessita de um sistema circulatório eficiente para desenvolver-se • Capacidade de expressar mutações induzidas

4. Ovos transparentes e pequeno tamanho (http://pharyngula.org/images/larvae.jpg)

5. Estágios do desenvolvimento embrionário

6. Fotos do desenvolvimento

7. Animação do desenvolvimento

8. Domínios da molécula de colágeno VI N1 C1 C2 1(VI) N1 C1 C2 2(VI) 3(VI) N9 N5 N1 C1 C2 C3 C4 C5 0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000 aa CHU et al., 1990

9. Colágeno tipo VI: das cadeias  à microfibrila 3 Monômero 2 Dímero 1 Colágeno tipo VI Tetrâmero Microfibrila

10. Aspectos do desenvolvimento cardíaco • Especificação de cada tipo celular: 16 hpf • Endocárdicas X miocárdicas • Atriais X ventriculares • Migração celular e formação do tubo cardíaco na linha mediana • Remodelamento do tubo cardíaco com a formação do coração funcional

11. (Satainier D.Y., 2001) • Especificação das células precursoras • Formação de grupos laterais • As células endocárdicas migram mais medialmente que as miocárdicas • Forma-se uma estrutura em forma de funil com 22 hpf • Coração tubular com 24 hpf – batimentos cardíacos • Looping com 36 hpf • células ventriculares • células atrias • células do miocárdio • células do endocárdio

12. Formação cardíaca • Os precursores ventriculares estão marcados em verde e as atriais em vermelho • As células ventriculares migram medialmente em relação às células atriais • A fusão ocorre primeiramente na região posterior • Na seqüência, há a fusão na área anterior, formando um alo central. • Coração tubular com 24 hpf (Glickman e Yelon, 2002)

13. Formação dos Coxins endocárdicos • De 1 a 2% dos nativivos apresentam alguma doença cardíaca congênita (HCD) • Algumas das malformações cardíacas são devidas à problemas na formação dos coxins • Alterações na expressão de colágeno VI são associadas à malformações • Processo extensivamente estudado em outros modelos, mas o zebrafish apresenta vantagens, como a expressão de mutações induzidas • Fornece um sistema simplificado da função gênica

14. A-B As células endocárdicas no canal AV são cúbicas, enquanto as restantes são pavimentosas • C-D Expressam Dm-grasp, molécula de adesão superficial da superfamília das Igs. (Beis et al., 2005)

15. Com 55 hpf, as células cúbicas continuam expressando Z01, molécula associada a tight junctions, marcadora de tecido epitelial. • Com 60 hpf, há diminuição na expressão de Z01, indicando a ocorrência de transformação epitélio-mesenquimal • Durante esse processo, observa-se a migração das células endocárdicas pela ECM em direção aos miocárdicos • Com 7 dpf, as valvas estão completamente formadas • No coração adulto, observa-se a presença de 4 válvulas na valva atrioventricular (Beis et al., 2005)

16. Resultados Limitações: Dificuldade em obter cortes que contenham o coração e que estejam em uma boa orientação O microscópio confocal ter ficado estragado durante quase todo o semestre Forte marcação em uma área externa ao coração parecendo ser Hatching gland contidas no pericárdio

17. Colágeno VI – 48 hpf - Aumento 40 X C A A: Marcação para colágeno VI B: Morfologia C: Controle D: Imagem sobreposta de A em B B D

18. Colágeno VI – 48hpf - Aumento 63 X C A A: Marcação para colágeno VI B: Morfologia C: Controle D: Imagem sobreposta de A em B B D

19. Imunofluorescência do coração inteiro – Col. VI – 75 hpf

20. Discussão • Forte marcação em uma área externa ao coração parecendo ser Hatching gland contidas no pericárdio • Por quê no coração inteiro houve marcação ??? • Necessidade de testar outros anticorpos • Aprimorar técnicas de dissecação

21. Perspectivas • Boas perspectivas, uma vez que em outros modelos já existem trabalhos semelhantes • Entender a marcação de hatching gland • Quando houver padronização das técnicas, fazer imunofluorescência e whole mount para outros colágenos.

22. Perspectivas e objetivos (Kolker S. J., 2000)

23. Agradecimentos • À Deus, pela saúde e perseverança • Aos meus pais e familiares • À Cristiane, pelo carinho e amor incondicionais • Ao Greg, pelos ensinamentos e paciência de um verdadeiro mestre • Ao pessoal do laboratório, em especial a Elisandra e a Lorenza • À Cleida, pela oportunidade e exemplo de organização • Aos fornecedores de ovos de Zebrafish • Aos colegas do PAD pelos momentos vividos • E ao povo brasileiro, pelo financiamento. Obrigado pela Atenção!