PHA production, from bacteria to plants

1. PHA production, from bacteria to plants 徐献毅

2. 图1：含有PHA的细菌电镜照片 图2：PHA的结构通式 背景介绍 • 聚羟基脂肪酸酯 polyhydroxyalkanoates (PHA) • 由微生物合成的一类生物聚酯 • 作为细胞内的碳源和能量的储存物质 • 具有生物可降解性和生物相容性

3. O —[O—*CH—(CH2)m—C—]n—— R O O O O O O O O O O O O 3HDD 3HO 3HD 3HHx 3HB 3HV PHA 结构的多样性 C9H19 C2H5 C7H15 CH3 C5H11 C3H7 PHA结构的多样性为设计、合成 新型材料提供了前提。

4. 本实验所生产：PHA 的化学结构 O O —[CH—CH2—C—O]a——[CH—CH2—C—O]b— • PHA共聚酯: 含有两种以上的单体成分 CH3 C2H5 P(3HB-co-3HV) 聚羟基丁酸羟基戊酸酯 (PHBV)

5. Abstract • The genes encoding the polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthetic pathway in Ralstonia eutropha (3-ketothiolase, phaA orbktB ; acetoacetyl-CoA reductase, phaB ; and PHA synthase, phaC ) were engineered for plant plastid targeting and expressed using leaf (e35S) or seed-specific (7s or lesquerella hydroxylase) promoters in Arabidopsis and Brassica. PHA yields in homozygous transformants were 12–13% of the dry mass in homozygous Arabidopsis plants and approximately 7% of the seed weight in seeds from heterozygous canola plants. When a threonine deaminase was expressed in addition to bktB, phaB and phaC, a copolyester of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyvalerate was produced in both Arabidopsis and Brassica.

6. significance • PHA具有良好的材料性能，类似于石油化工材料，如：聚乙烯，聚丙烯。但是通过菌体发酵过程生产的日用品，比石油化工产品昂贵许多。不具有商业上的竞争性。因此本实验设想: • PHA production in plant systems may lead to lower costs by using CO2 for carbon and sunlight for energy. • In addition, a plant production system may have a lower overall environmental impact.

7. 模式植物Arabidopsis thalianna生产PHB的尝试 • 利用内源的3-ketothiolase，外源的phaB,phaC生产的PHB的含量只有0.14%干重。产量非常低。并且发现外源的phaB或phaB和phaC同时表达细胞质时，植物生长受抑制很严重。 • 分析原因：（异源的PHB在植株中合成消耗了细胞质中大约50%的乙酰CoA. 可能由于乙酰CoA分流过多, 导致内源异戊二烯类和类黄酮等重要物质合成的底物不足而影响了植株的正常生长发育；也可能因为PHB在细胞质、液泡和细胞核中的积累对植物生长产生毒害作用, 尤其是在细胞核中的PHB可能与DNA相作用.）

8. 尝试实验中受到的启发： • 实验发现：没有在质体和线粒体中发现PHB颗粒。原因可能是PHB颗粒的疏水性，使其只能进入单层膜细胞器而不能进入双层膜细胞器中。（设想：选择目标为质体） • 质体中进行着旺盛的从碳源转向乙酰COA的代谢，含有丰富的乙酰COA。并且当光合作用旺盛时，以淀粉粒的形式暂时储存在叶绿体时，发现并没有对叶绿体的功能产生影响。

9. 改进方案： • PHA accumulation In the plastids： • All three genes from the PHA biosynthetic pathway from R. eutropha, consisting of the 3-ketothiolase (phaA ), phaB and phaC, were N-ter-minally fused to chloroplast transit peptides and ex-pressed under 35S promoter control. Plants harboring the complete PHA biosynthetic pathway were obtained by crossing experiments. One of the resulting plants accumulated approximately 14% PHB as CDM。

10. 转基因油菜种子生产PHB的尝试 • 原因：油菜作为世界第一大油料作物，其体内脂肪酸合成旺盛，是生产PHB的合适目标。 • 位点：定位于种子的质体，即把PHB的合成限定于特定细胞器、特定组织、特定发育阶段, 不仅可以最大限度地减少PHB合成对植物生长发育的影响并提高产量, 还可有利于PHB的提取。 • 方法：利用从拟南芥的12S种子储存蛋白CRB的编码基因中分离出来的启动子, 连同叶绿体导肽, 将PHB的合成定位于油菜种子的胚中, PHB最终含量达种子鲜重的1%.

11. 利用转基因植物生产phbv的研究 • PHBV具有较好的柔韧性和较低的熔点，比PHB更适合生产塑料。 • 由于eutropha的phaA基因产物不能有效地催化丙酰CoA和乙酰CoA合成酮戊酰CoA,他们从eutropha克隆了另一个酮硫裂解酶基因——bktB. bktB基因产物可有效地催化丙酰CoA和乙酰CoA合成β-酮戊酰CoA,进一步与乙酰乙酰CoA在phaB和phaC基因产物的催化下合成PHBV,丙酰CoA则来源于苏氨酸. 在植物体内,苏氨酸在脱氨酶的作用下转化为β－酮丁酸,内源的丙酮酸脱氢酶催化β－酮丁酸转化为丙酰CoA。

12. PHBV代谢途径

13. 结果：将PHA合成的所需酶的基因导入到拟南芥质体中:通过实验获得了最高占植株的干重0.8%的产率。并且3HV的含量在4-17%之间变化。结果：将PHA合成的所需酶的基因导入到拟南芥质体中:通过实验获得了最高占植株的干重0.8%的产率。并且3HV的含量在4-17%之间变化。

14. 转基因植物生产PHA的问题与展望 转基因植物中合成的PHA含量还很低,种类也比较单一 。提高PHA在植物体内表达量的研究外,同时也要注意增加PHA的品种,尤其是物理机械特性更佳的PHA。 为此可考虑从以下几个方面来进行：(1) 尽量避免基因沉默现象,最大限度地提高转基因植物中PHA合成基因表达的稳定性。 (2) 加强植物体内脂肪酸代谢的研究。 (3) 以PHA颗粒替代油脂体。 (4)寻找更适合的合成PHA的场所。如马铃薯。 马铃薯块茎是大有希望的PHA合成位点, 因为马铃薯的块茎产量大大 高于油料作物的种子, 价格也低廉得多, 可以通过无性繁殖方式大量、快 速地繁殖, 而且已经获得转PHB合成酶基因的马铃薯植株, 只要我们加强 碳代谢调控的研究, 尽快找到从碳源流向乙酰CoA的调控方法, 有可能比 利用油料作物生产PHB更具有优势。

15. 关于Canola oil(改良油菜子油) • Canola oil 是用经基因改良的油菜(Rape，Brassica napus) 种子榨出的食用油。精制(refined)后的Canola oil含59%单不饱和脂肪酸，22%多不饱和脂肪酸和7%饱和脂肪酸。<2%芥酸，erucic acid。未 经基因改良的油菜子油（普通）中芥酸含量可高达30-60% (如中国原产油菜子油) 。芥酸在试验动物中可引发心肌坏死(heart lesions)，所以1986年以前，油菜子油在美国的主要用途为工业原料(可怜中国人祖祖辈辈吃了几千年！)。基因改良后的油菜子油的芥酸含量少于 2%，而且含大量不饱和脂肪酸，因而成为健康食用油。但由於Canola oil含不饱和脂肪酸多，高温下易分解生成致肺癌的化学物，不适用传统的中式烹调(热油锅)。

16. THANKS FOR YOUR ATTENTION!