Diagnostic biologiques

1. Diagnostic biologiques Du dépistage au suivi de l’infection 18 juin 2013 Dr NDAYIKUNDA Claudette

2. OBJECTIF • Connaître les différents tests biologiques utilisés pour le dépistage du VIH • Savoir interpréter le résultat d’un test de dépistage du VIH • Connaître les différents tests biologiques utilisés pour le suivi d’un patient infecté par la VIH • Savoir proposer les tests biologiques appropriés à la situation clinique

3. Comment détecter le virus ? • En cherchant des traces directes du virus • Virus entier • Culture cellulaire • Particules liés au virus • Antigène • Antigénémie P24 • Génome viral • Charge virale VIH • En cherchant des traces indirectes du virus • Sérologie

4. Le dépistage

5. Les tests « sérologiques » • Sérologie • Détection de particules dans le « sérum » • Antigènes ou anticorps • Quelles méthodes de sérologie • Tests rapides • Tests « ELISA » • Tests Western Blot

6. Cinétique des marqueurs au cours de l’infection par VIH-1 • Tests utilisés: • ELISA; • Tests rapides • L’apparition des anticorps demande un certain délai : fenêtre sérologique: 21J (6 à 38j selon les techniques). • Pendant cette période, sujet est contagieux mais la sérologie est négative

7. Technique ELISA • ELISA: Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay • Principe du test • Mise en évidence d’anticorps présents dans un sérum par la visualisation d’une réaction colorée

8. Tests de 4ème génération

9. Test ELISA

10. Tests rapides • Principe proche de l’ELISA • Permetde faire le dépistage d’anticorps anti-VIH en moins de 30 minutes par simple lecture visuelle • Sensibilité comparable à celle des ELISA

11. Méthode immunofiltration

12. Test Rapide Détermine • Le Test Rapide Détermine est un test Immunochromatographique

13. Tests Rapides pour la détection d’anticorps anti-VIH • Determine • Oraquik* • Unigold* • Multispot* • Stat-pak • Hemastrip • SUDS* • Capillus • Abbot Laboratories • OraSure • Trinity Biotech • Trinity Biotech • Chembio Diagnostic Systems • SDS • Abbott Laboratories • Trinity Biotech *Apprové par la FDA

14. Test de confirmation (Western Blot) • Met en évidence les anticorps anti-VIH1 ou VIH2, spécifiques des différentes protéines virales. • Avantages et utilisation • Test spécifique • Permet de trancher s’il y a une discordance avec les autres tests • Dans certains pays : utilisé comme test de confirmation si l’ELISA est positif

15. Western Blot

16. VIH-1 VIH-2 gp140 gp160 gp105 gp110 68 68 56 55 gp41 40 gp36 34 26 25 18 16 Diagnostic sérologique de l'infection par le VIH Tests ELISA • Très bonne sensibilité ; spécificité > 99 % • Temps de réalisation = 2-3 heures Test de Western Blot = CONFIRMATION si nécessaire • Positivité du test si présence d'au moins 3 anticorps dont au moins 2 anticorps anti-enveloppe • Pratiqué si test(s) ELISA positif(s) • Moins sensible, plus spécifique

17. Organisation du génome du VIH Why mucosal vaccination gp41 gp120 env gag pol vif vpu nef vpr tat tat rev rev intégrase protéase RT p17 MA p24 CA p7 NC Glycoprotéines de l’enveloppe UR3 RU5 Enzymes virales Protéines internes Protéines virales régulatrices

18. Critères d’interprétation du Western Blot • 2) Western –blot positif: varie selon les institutions

19. Critères d’interprétation du Western Blot • 1) Western –blot négatif: absence de bandes

20. Critères d’interprétation du Western Blot • 3)Western blot INDETERMINE : ni positif, ni négatif

21. Critères d’interprétation du Western Blot • En cas de Western blot INDETERMINE • il faut rechercher : • Une séroconversion (ag p24) • Une infection par le VIH-2 • Une infection par un variant VIH-1 • Une reactivité non spécifique

22. Avantages et inconvénients des tests utilisés • Tests rapides • Avantages • Remise « immédiate » du résultat • Sensibilité et spécificité comparable à celle des ELISA • Inconvénients • Pas adapté au traitement de grands nombres d’échantillons • ELISA • Avantages • Permet l’analyse de grands volumes de spécimens • Inconvénients • Matériel sophistiqué • Personnel qualifié • Entretien du matériel • Source continue d’énergie électrique

23. Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • Décompte des lymphocytes T (CD 4) • Charge virale • Hémogramme • Chimie sanguine • Examen parasitologique des selles • Examen de crachats • Sérologies pour les pathologies associées • Toxoplasmose • Syphilis • Cytomegalovirus

24. Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • Décompte des lymphocytes T (CD 4) • Charge virale • Hémogramme • Chimie sanguine • Examen parasitologique des selles • Examen de crachats • Sérologies pour les pathologies associées • Toxoplasmose • Syphilis • Cytomegalovirus

25. Décompte des CD4 • Pourquoi compter les CD4 ? • Leur niveau est corrélé au fonctionnement du système immunitaire • Indicateur d’initiation du traitement ARV

26. Interprétation de la mesure des CD4 • Valeurs normales : 1000/mm3 • Infections opportunistes mineures : CD4 entre 350 et 200/mm3 • Infections opportunistes majeures (SIDA) • CD4 < 200/mm3 • %CD4, rapport CD4/CD8 • pas d’intérêt (sauf enfants) • Possibles valeurs aberrantes • Infection aiguë • Problèmes techniques

27. Evolution des CD4 sous traitement • La remontée des CD4 est imprévisible • Vitesse de remontée ? • Niveau atteint sous traitement ? • Niveau de départ important +++ • Plus on part de bas, moins cela remontera haut… • Les CD4 continuent à augmenter plusieurs années après la mise sous traitement

28. Méthodes de décompte des CD4+ • Méthode manuelle de décompte : Cyto Sphères (COULTER ) • Très long… • Méthode automatisée de décompte: cytométrie de flux • Permet de traiter un très grand bombre d’échantillon • Très exigeant • Nécessite appareil de mesure, réactifs particuliers, « consommables » particuliers… • Très peu de pays en développement arrivent à faire fonctionner la technique… • Nouvelles méthodes • Appareils portatifs, système à « cassette », un échantillon/20 minutes

29. Décompte manuel (Coulter)

30. Cytométrie de Flux

31. Tests de suivi des PVVIH • Décompte des lymphocytes T (CD 4) • Charge virale • Tests diagnostiques de la Syphilis • Hémogramme • Examen des selles pour la recherche des parasites et des coccidies • Examen des crachats • Test de grossesse • Chimie sanguine/Bilan hépatique

32. Charge virale (1) • Amplification génique de l’ARN viral • Expression du résultat • En nombre de « copies » de virus par mL de plasma • Par exemple 145 000 copies/mL • Parfois exprimé en log10 de ce chiffre • 145 000 = 5,16 Log10 • Technique • Très exigeant • Nécessite appareil pour la charge virale, laboratoire spécial, centrifugeuses, hottes de préparation, réactifs particuliers, « consommables » particuliers, congélateurs à -80°C… • Très peu de pays en développement arrivent à faire fonctionner la technique…

33. Charge Virale (2) • Intérêt • Avant traitement • Intérêt modéré • Permet d’avoir une idée de la rapidité d’évolution de l’infection • Sous traitement • EXAMEN ESSENTIEL ++++ • Seule méthode biologique fiable d’évaluation de l'efficacité du traitement

34. Charge virale (3) • Sous traitement • La charge virale diminue très vite • La charge virale doit être indétectable après 6 mois de trithérapie • La charge virale doit rester en permanence indétectable sous traitement • Gage d'efficacité des traitements à long terme

35. Etats du virus dans la circulation Lympho CD4 au repos Lympho CD4 activé Virus latent Virus en réplication LYMPHOCYTES T4 CIRCULANTS PCR ADN VIH Virus libre PCR ARN VIH ou Charge virale Antigène p24 soluble Complexée à des Ac Libre PLASMA Apres Dissoc. Ag p24 Burgard, V

36. Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • Décompte des lymphocytes T (CD 4) • Charge virale • Hémogramme • Chimie sanguine • Examen parasitologique des selles • Examen de crachats • Sérologies pour les pathologies associées • Toxoplasmose • Syphilis • Cytomegalovirus

37. Hémogramme • Etude qualitative et quantitative des éléments trouvés dans le sang humain. • Il est important dans l’initiation du traitement et le suivi du patient sous ARV.

38. Paramètres les plus importants • Numération cellulaire • Décompte des globules blancs • Décompte des globules rouges • Décompte des plaquettes • Hémoglobine • Volume globulaire

39. Méthodes utilisées • Méthode automatique • Les cellules sanguines sont comptées selon leurs tailles. • Méthode manuelle • Les cellules sanguines sont comptées en utilisant un hématimètre après dilution

40. Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • Décompte des lymphocytes T (CD 4) • Charge virale • Hémogramme • Chimie sanguine • Examen parasitologique des selles • Examen de crachats • Sérologies pour les pathologies associées • Toxoplasmose • Syphilis • Cytomegalovirus

41. Importance de la biochimie • Les tests de la chimie sanguine permettent: • D’évaluer la façon dont le patient pourra tolérer certains traitements • De faire le bilan de certaines « comorbidités » avant traitement • Hépatite • Insuffisance rénale • Diabète • … • De faire le suivi du patient déjà sous thérapie pour déceler tout effet secondaire cliniquement silencieux

42. Chimie sanguine • Les tests de la chimie sanguine comportent: • Un bilan hépatique et pancréatique • SGOT, SGPT, Bilirubine, phosphatase alcaline, glycémie (amylase, lipase) • Un bilan rénal • Créatine, urée • Un bilan lipidique • Cholestérol (+ fractions LDL et HDL) • Triglycérides

43. Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • Décompte des lymphocytes T (CD 4) • Charge virale • Hémogramme • Chimie sanguine • Examen parasitologique des selles • Examen de crachats • Sérologies pour les pathologies associées • Toxoplasmose • Syphilis • Cytomegalovirus

44. Techniques et coloration des selles • Techniques • Examen direct • Concentration des selles • Enrichissement des selles • Colorations • Etat frais dilué au sérum physiologique • Colorations diverses en fonction des parasites recherchés

45. Recherche des leucocytes dans les selles • Coloration au bleu de Méthylène • La présence de beaucoup de polynucléaires peut indiquer une atteinte invasive d’origine bactérienne, alors que les éosinophiles attirent l’attention sur une atteinte parasitaire

46. Interprétation des résultats Négatif: Absence de parasites ou d’œufs Positif: Présence de parasites ou d’œufs

47. Recherche de Coccidies • Méthode de coloration de Ziehl Nielsen modifiée • Les principales coccidies sont: • Cryptosporidium • Cyclospora • Isospora belli

48. Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • Décompte des lymphocytes T (CD 4) • Charge virale • Hémogramme • Chimie sanguine • Examen parasitologique des selles • Examen de crachats • Sérologies pour les pathologies associées • Toxoplasmose • Syphilis • Cytomegalovirus

49. Analyse des crachats = recherche de tuberculose • La tuberculose est l’infection opportuniste prédominante chez les patients VIH+ • Importance +++ • Du diagnostic en cas de symptômes • Du dépistage en l’absence de symptômes

50. Recherche des Bacilles Acido Alcoolo Résistants (BAAR) • Coloration de Ziehl Nielsen • Étalement des crachats • Faire sécher le frottis à l’air libre • Fixer le frottis • Colorer (Ziehl Nielsen)