campione

1. quantificazione del complesso antigene-anticorpo complesso antigene-anticorpo campione + anticorpo METODI IMMUNOMETRICI • I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse.

2. epitopo CDR paratopo frammento Fab frammento Fab antigene ponte disolfuro intracatena ponte disolfuro intercatena Catena L frammento Fc Catena H ANTICORPI IgG - anticorpi che tendono a durare molto a lungo, anche tutta la vita;IgM - durano poco tempo, e indicano un contatto recente con l'antigene;IgA - non si misurano nel sangue, ma sono presenti sulla superficie di alcuni organi, come per esempio gli alveoli polmonari;IgD - presenti sulla superficie dei linfociti B maturi;IgE - immunoglobuline che intervengono nei processi che regolano le reazioni allergiche (ipersensibilità nei confronti di vari antigeni, alimentari, ambientali, ecc.). Anticorpi monoclonali Anticorpi policlonali

3. METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE In opportune condizioni la formazione del complesso antigene-anticorpo dà luogo ad una reazione di precipitazione. -(A) Eccesso di anticorpo (Ab) -(B) Zona di equivalenza (zona più interessante a fini analitici). -(C) Eccesso di Ag Ab precipitato A B C Ag

4. METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE La “composizione” del precipitato varia fortemente nelle tre zone. La precipitazione degli aggregati antigene-anticorpo (reazione di immunoprecipitazione) rappresenta una tecnica molto utilizzata per l’analisi qualitativa e quantitativa di componenti relativamente abbondanti nel siero, in particolare delle proteine sieriche. Nell’ambito delle tecniche basate su reazioni di immunoprecipitazione abbiamo: -Tecniche basate sulla diffusione -Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida -Tecniche di tipo elettroforetico In senso lato, anche le tecniche immunometriche propriamente dette (es. tecniche immunoenzimatiche) si possono considerare tecniche di immunoprecipitazione. Ab precipitato A B C Ag

6. METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE Diffusione monodimensionale semplice: la soluzione contenente (potenzialmente) l’antigene in esame viene stratificata sopra un gel di agar contenente un opportuno antisiero. Diffusione monodimensionale doppia: fra le due soluzioni viene interposto un ulteriore stato di gel di agar (“zona neutra”). Le bande si formano quindi dove la diffusione di entrambe le specie porta al raggiungimento dei rapporti ottimali di concentrazione antigene/anticorpo. Soluzione contenente l’antigene Diffusione Gel di agar contenente l’antisiero Zona neutra Diffusione

7. METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE Soluzione contenente l’anticorpo Soluzioni contenente l’antigene Nelle tecniche di diffusione bidimensionale si utilizza uno strato di gel di agar, nel quale sono stati ricavati pozzetti nei quali vengono poste le soluzioni in esame e la soluzione di anticorpo. A seguito della diffusione radiale dei vari componenti, ove possibile si formano “archi” di precipitato che identificano l’avvenimento della reazione antigene-anticorpo. Con opportune modificazioni questa tecnica è applicabile anche a fini quantitativi (es. tecniche di immunodiffusione radiale: usando solo l’antigene nei pozzetti, mentre l’anticorpo è disciolto nel gel di agar, l’area delle bande che si formano è proporzionale alla concentrazione dell’antigene). Reazione antigene-anticorpo Nessuna reazione Diffusione

8. IMMUNODIFFUSIONE RADIALE SEMPLICE: ESEMPIO

9. IMMUNODIFFUSIONE RADIALE DOPPIA: ESEMPIO

10. METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE Immunoelettroforesi: - elettroforesi - deposito di antisiero REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE Elementi corpuscolari (globuli rossi, batteri,…): - provetta - vetrino

11. REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE: ESEMPIO TEST DI GRACIDANZA

12. REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE

13. METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida Nelle tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida il precipitato formatosi a seguito della reazione antigene-anticorpo viene di solito quantificato attraverso l’effetto Tyndall, La quantificazione del precipitato può avvenire mediante turbidimetria o nefelometria (la seconda è nettamente più sensibile, permettendo di raggiungere limiti di rivelazione nettamente minori di quelli ottenibili con le tecniche di diffusione). Misura della luce “assorbita”: turbidimetria Luce incidente Misura della luce diffusa: nefelometria

14. IMMUNODOSAGGI Utilizzo di traccianti per rivelare la formazione del complesso antigene-anticorpo Metodi competitivi Metodi non competitivi

15. 1 2 3 Tracciante legato 3 2 1 0 4 16 Conc. analita METODO COMPETITIVO per la detrminazione di Ag a) aggiunta reattivi tracciante analita b) reazione c) Aggiunta substrato Siti anticorpali in difetto Concentrazione costante di tracciante

16. Separazione Competizione per il sito anticorpale Aggiunta antigene e anticorpo Substrato Segnale E E E E E E E E E E E E Misura dell’attività enzimatica Aggiunta dell’anticorpo marcato Analita libero Anticorpo anti-analita E METODO COMPETITIVO per la detrminazione di Ab Anticorpoanti-IgG marcato Analita immobilizzato

17. METODI NON COMPETITIVI per la detrminazione di Ag Segnale Concentrazione analita Siti anticorpali in eccesso DIRETTI INDIRETTI saturazione aspecifico In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa della saturazione dell’anticorpo di cattura o di rivelazione.

18. METODI NON COMPETITIVI per la detrminazione di Ab Segnale Concentrazione analita

19. ESEMPI DI TEST COMPETITIVI E NON COMPETITIVI

20. Modulazione di attività (MA)(Metodi competitivi) Amplificazione di attività (AA) (Metodi non competitivi) Limite di rivelazione più basso Specificità intrinseca superiore L’utilizzo di anticorpi monoclonali migliora la specificità Più rapidi, particolarmente a basse concentrazioni di analita. METODI COMPETITIVI E NON COMPETITIVI (MA E AA) CARATTERISTICHE

21. METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI TRACCIANTI Nei metodi basati su reazioni di immunoprecipitazione la formazione del complesso antigene-anticorpo viene evidenziata attraverso la diffusione della luce determinata dal precipitato. Per analiti presenti in concentrazioni molto basse e/o per i quali il complesso antigene-anticorpo non precipita (es. molecole di piccole dimensioni) i metodi di immunoprecipitazione non sono applicabili o sono troppo poco sensibili. Purtroppo la reazione è difficilmente rivelabile sfruttando le diverse proprietà fisiche del complesso An-Ab rispetto ad An libero. Sebbene metodi immunometrici “label-free” siano in linea di principio utilizzabili (es. misurando le differenze di massa misurabili con biosensori piezoelettrici o le diverse proprietà ottiche con un sistema basato sulla SPR come il sistema Biacore) è’ più pratico utilizzare un tracciante, cioè un reattivo che, partecipando alla reazione An-Ab in opportune condizioni, ne permetta la rivelazione sensibile. An + Ab An-Ab

22. LABEL Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, abbassando il limite di rivelazione del metodo. • Isotopi radioattivi (125I, 3H) • Molecole fluorescenti • - fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina) • - fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi: Eu3+, Tb3+) • - fluorescenza polarizzata (fluoresceina) • Molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio) • Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, b-galattosidasi) determinabili con substrati • - cromogenici • - fluorescenti • - chemiluminescenti

23. SCELTA DEL LABEL

24. METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. S E La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

25. METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) • Vantaggi relativi all’uso di enzimi: • sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; • sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; • una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; • è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. • Svantaggi relativi all’uso di enzimi: • l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; • la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; • si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.

26. TRACCIANTI ENZIMATICI ENZIMA SISTEMA DI RIVELAZIONE METODOLOGIA ANALITICA Perossidasi H2O2/cromogeno Spettrofotometria H2O2/luminolo Chemiluminescenza Fosfatasi alcalina 4-nitrofenilfosfato Spettrofotometria 4-metilumbelliferone-fosfato Fluorimetria AMPPD Chemiluminescenza -galattosidasi 2-nitrofenolo Spettrofotometria 4-metilumbelliferone Fluorimetria 2-naphthyl--D-galactopyranoside Chemiluminescenza La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria. L’uso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.

27. MARCATORI DEI SAGGLI IMMUNOCHIMICI IN CHIMICA CLINICA Fosfatasi alcalina, Galattosidasi, Glucosio ossidasi, Lisozima, Perossidasi di rafano (HRP) Enzimi (Metodi EIA) Fluorofori Molecole chemiluminescenti Sistemi bioluminescenti Fluorescina Chelati di europio Luminolo, Rutenio, Europio Luciferasi/luciferina

28. Le più comuni applicazioni dei metodi immunometrici in chimica analitica clinica riguardano la determinazione di: • ormoni nei fluidi biologici (sangue, urina, saliva) • farmaci nel siero e nelle urine (antiepilettici, antidepressivi, cardioattivi, immunosoppressivi, antibiotici, ecc...) • droghe d’abuso nei fluidi biologici (oppiacei, allucinogeni, cannabinoidi, cocaine) • Immunoglobuline nel sangue, IgE e allergeni vari e IgD nel siero, proteine di derivazione tubulare e glomerulare nelle urine • Interleuchine • diagnosi di Helicobacter pylori, Herpes, Rubella, Brucella, Toxoplasma, Epatite

29. SENSIBILITA’ DEI METODI IMMUNOMETRICI

30. INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI • I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono: • la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo per il legame con l’antigene (es proteine del siero, autoanticorpi, anticorpi eterofili, anticorpi umani anti-topo, eccesso di anigene), ecc; • la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.

31. fluoroforo luce assorbita luce emessa Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) • L’efficienza dell’assorbimento della luce da parte di un fluoroforo dipende dall’angolo tra il dipolo elettronico della luce eccitatrice e l’oscillatore nella molecola. • Una luce polarizzata su un piano ecciterà in maniera efficiente solo quelle molecole che hanno i loro oscillatori orientati opportunamente (di solito parallelamente) rispetto al piano della luce eccitatrice. Se il fluoroforo è fermo, il piano di polarizzazione della luce emessa sarà parallelo a quello della luce assorbita.

32. fluoroforo fisso fluoroforo libero di ruotare La polarizzazione viene mantenuta La polarizzazione viene persa Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) • Il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende dal tempo di emivita dello stato eccitato () e dal movimento rotatorio della molecola. • Se il tempo richiesto al fluoroforo per ruotare è confrontabile con , esso cambierà posizione prima di emettere fluorescenza e quindi la luce emessa perderà parzialmente o completamente la polarizzazione.

33. Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di movimento di circa 10-100 ns, mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 0,1-1 ns. In condizioni di eccitazione costanti l’emissione polarizzata sarà funzione delle dimensioni del fluoroforo e del rapporto tra tempo di rilassamento rotazionale e tempo di decadimento della fluorescenza. L’analita è marcato con una molecola fluorescente. Mediante misure di FP è possibile misurare la frazione di tracciante legato all’anticorpo in fase omogenea. Infatti il tracciante legato mantiene un grado di polarizzazione maggiore rispetto al tracciante libero. Perché ciò si verifichi, il tempo di decadimento della fluorescenza deve essere più lungo del tempo di rotazione del farmaco e più breve del tempo di rotazione del complesso antigene-anticorpo.

34. METODI IMMUNOMETRICI E FLUORESCENZA RISOLTA NEL TEMPO (DELFIA) • Forme chelate dei lantanidi con tempi di decadimento della • fluorescenza lunghi (10-100 ms) • Breve durata della fluorescenza dei materiali biologici naturali (1-20 ns)

35. METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (I) Il complesso di rutenio, solitamente utilizzato come marcatore, non si consuma durante la reazione (a differenza dell’ammina alifatica), svolgendo quindi un ruolo paragonabile a quello di un enzima. fotone (l ~ 620 nm) Ru(bpy)32+ Ru(bpy)32+* prodotti TPA: tripropilammina TPA● - H+ Ru(bpy)33+ Ru(bpy)32+ TPA+ TPA e- e-

36. METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (II) Dal punto di vista analitico, l’ECL è particolarmente interessante in confronto ai normali sistemi chemiluminescenti, in quanto: La reazione chemiluminescente può essere facilmente controllata mediante applicazione di un opportuno potenziale Il rapporto segnale/rumore di un sistema ECL è di solito maggiore di quello dei sistemi chemiluminescenti “chimici” basati su catalizzatori enzimatici o su molecole spontaneamente chemiluminescenti.

37. METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (III) • VANTAGGI: • E’ una reazione ciclica e quindi può essere considerata un sistema amplificato • Può essere “accesa” e “spenta” (la reazione avviene solo se avviata elettrochimicamente) • Non ha segnale di fondo • Per questi motivi è abbastanza diffusa nei sistemi automatizzati di analisi clinica (uno dei sistemi attualmente in commercio combina la chemiluminescenza elettrogenerata con l’usi di supporti magnetici sui quali sono immobilizzati gli anticorpi per attuare metodi immunimetrici eterogenei con rivelazione chemiluminescente)

38. METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (IV) Analizzatore Elecsys, prodotto dalla Roche Elettrodi per la produzione del segnale ECL magnete Fasi di reazione e lavaggio: microsfere in sospensione Fasi di eliminazione della soluzione: microsfere trattenute dal magnete

39. METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (V) Sono a tutt’oggi disponibili oltre 50 metodi immunometrici per sistemi Elecsys:

40. IMMUNODOSAGGI MEDIANTE IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA enzima biotina avidina MARCATURA CON IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA TECNICA DEL PONTE AVIDINA-BIOTINA

41. METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI • Eterogenei (su fase solida): • (i metodi EIA eterogenei sono ELISA=enzyme linked immunoadsorbent immunoassay) • determinazione delle IgE, IgG e immunocomplessi. Determinazione di ormoni, insulina. Diagnosi di malattie infettive. Determinazione di antigeni di superficie delle epatiti. • Omogenei (in fase liquida): • - determinazione di farmaci o droghe nell’urina (anfetamine, barbiturici, metadone, oppiacei) e nel plasma (digossina, Fenobarbital).

42. Metodi omogenei Metodi eterogenei Esecuzione semplice e rapida Esecuzione del metodo più complicata Possono essere automatizzati facilmente Difficili da automatizzare Limiti di rivelazione più elevati Bassi limiti di rivelazione Ambito dinamico del metodo inferiore Ampio ambito dinamico del metodo Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI CARATTERISTICHE

43. COME SI OTTIENE UN ANTICORPO Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è un antigene in grado di stimolare una risposta immunitaria solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. Mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi policlonali, diretti verso i diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità. È anche possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo.

44. ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (II) IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma. Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali

45. POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow immunoassay C C T T S S Negativo Positivo Permettono un’analisi qualitativa o semi-quantitativa molto rapida

46. Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina umana (immunoglobulina G) Marcatore: oro colloidale Linearità: da negativo a 100 mg/l Intervalli di lettura:   - da negativo a 20 mg/l    - da 20 a 50 mg/l    - da 50 a 100 mg/l    - superiore a 100 mg/l Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti Performance del test:   - sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l    - specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l    - valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l    - valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30 °C Fattori di interferenza:   - nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante    - nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del 15%) Certificazione ISO 9002Conformità direttiva 98/79/CEE LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE

47. POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...)

48. METODI IMMUNOMETRICI IN CHIMICA CLINICA Sono commercialmente disponibili numerosissimi kit per analisi immunometrica, tipicamente con rivelazione colorimetrica, che permettono anche a laboratori piccoli e relativamente poco attrezzati di sfruttare i vantaggi di queste tecniche utilizzando strumentazione poco costosa.

49. METODI IMMUNOMETRICI IN CHIMICA CLINICA

50. METODI IMMUNOMETRICI IN CHIMICA CLINICA