Les anticorps monoclonaux et protéines de fusion thérapeutiques

1. Les anticorps monoclonaux et protéines de fusion thérapeutiques Pr Renato MONTEIRO Service d’Immunologie Hôpital Bichat

2. G. Köhler (1946-1995) et C. Milstein (1927-2002) • Travaux sur les myélomes • Protéine de Bence Jones • Publication en 1975 • Les hybridomes • Prix Nobel de médecine en 1984 avec N.K. Jernes • "for theories concerning the specificity in development and control of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies"

3. Définition • Anticorps monoclonal • Population homogène d ’anticorps issus d ’un « seul et unique » clone de cellules B • Avantage • Spécificité • Affinité • Production massive et constante

4. Différence entre sérum polyclonal et anticorps monoclonal

7. AICR Hypoxanthine Orotic acid FICR PRPP HGPRT Orotidine MP Guanine Inosine-5 P HGPRT Uridine MP Guanosine MP Adénosine MP Cytidine MP UPD Cytidine DP GDP ADP GTP dGTP ATP dATP CTP dCTP UTP dUMP DHFR RNA DNA dTTP dTDP TK Voie de synthèse des bases puriques et pyrimidiques Aminoptérine Aminoptérine

9. Les hybridomes

10. Synopsis Primo immunisation 2 semaines Rappel 1 - 3 mois Saignée Tests 10 jours Développer et tester la méthode de cribblage

11. La production Dernier rappel 3 jours Fusion 1 semaine Cribblage Expandre et congeler Clonage en cellule unique Cribblage et expansion des clones positifs

12. Production des anticorps monoclonaux • L'immunisation • Les sources d'antigènes • degré de pureté:élimination des contaminants • haptènes, protéines porteuses • L'immunisation de l'animal • dose et forme de l ’antigène • adjuvants • voie et nombre d ’injection

13. Immunogen Antigen Quantity of immunogen per injection & per mouse Protein lyophilized protein 2 - 50 µg in solution 2 - 50 µg included in polyacrylamide gel slices 1 - 10 µg Hapten Peptide 1 - 10 µg Nucleotide Carbohydrate and related compounds Chemicals (natural and synthetic compounds) Dose antigène

14. Adjuvants • Augmentation de l ’intensité de la réponse immunitaire • Accroissement de l ’effet mémoire • Stimulants non spécifiques de la réponse immunitaire • 3 composantes principales: • huile minérale/eau : protection de l ’antigène, transport de l ’antigène • particules : agrégation de l ’antigène, dépôt antigénique • parois de bactéries : réaction inflammatoire

15. Les animaux

16. day 0 7 15 21 28 35 Fusion injection 1st 2nd 3rd 5th 4th sera pre-immune Nombre d’injections Exemple : Immunisation d’une souris pour la fusion des lymphocytes des ganglions 6th Lapin : 120 à 200 µg Poulet : 40 à 80 µg Souris : 8 à 200 µg

17. General Procedure Step Time (month) 1 2 3 4 5 6 Develop and test screening method Immunisation Fusion, selection and screening Cloning and isotyping Delivery of clones Exemple de calendrier de production

18. Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome • Les partenaires de fusion • cellules B extraites d ’organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions) • cellules myélomateuses : cellules MOPC de souris Balb/c HGPRT- • Méthode de fusion • Chimique • Physique • Sélection, clonage • Expansion

19. Lignées cellulaires (myélomes)

20. Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome (2) • Fusion chimique: Poly Ethylène Glycol (PEG) • fusion des membranes cytoplasmiques • rendement de fusion de l ’ordre du % (1/10-5 cellules) • DMSO renforce la viabilité cellulaire • utilisation de facteurs de « rencontre » • Fusion physique : Electrofusion • Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques • technique onéreuse • moins destructrice

21. Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome (3) • Sélection sur milieu sélectif HAT • Hypoxanthine Aminopterine Thymidine • facteurs de croissance : IL6b mercaptoethanol • sérum de veau fœtal • fibroblastes • sous atmosphère CO2 • seuls les hybridomes se développent • 1 x 105 cellules/ml

22. Méthodes de criblage ou screening • Reproductible • Fiable • Rapide • Bon marché • Automatisable • Versatile

23. Méthodes de criblage ou screening • Immuno précipitation • Ouchterlony, Mancini • Réactions d ’agglutination • Hématies • Particules de latex • Radio immunologie (RIA) • radio isotope • Immuno enzymologie (EIA) • enzyme (ELISA) • Compteur de cellules (Cell sorter) • Western Blot

24. Immuno Analyse Enzymatique • 2 techniques • Compétition • Sandwich : la plus utilisée pour ce propos • « l ’antigène » est pris en sandwich entre deux anticorps: • l ’anticorps de capture immobilisé en excès sur la plaque solide • le conjugué enzymatique • Utilisé pour le dosage d ’antigènes multivalents • Poids moléculaire élevé de l ’antigène • étapes de séparations nécessaires

25. ELISA sandwich Elimination des antigènes non retenus Anticorps de capture immobilisés Antigènes à doser 1ère étape d ’incubation immunologique

26. ELISA sandwich Conjugué immuno-enzymatique 2ème étape d ’incubation immunologique

27. ELISA sandwich S P Produit coloré S P

28. ELISA P-nitrophényl Phosphate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate nitro blue tetrazolium Phosphatase alcaline Blotting Histologie Blotting Histologie Naphtol AS-TR phosphateFast red RC Enzymes et substrats

29. 2,2 ’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) ELISA ELISA ELISA O-phenylenediamine 3,3 ’-5,5 ’ teramethylbenzidine baseor dihydrochloride (TMB) Peroxidase 3,3 ’-diaminobenzidine Blotting Histologie Blotting Histologie Blotting Histologie 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) 4-chloro-1-naphtol (4ClN)

30. Sélection du clone producteur • Sélection d ’une seule cellules et mise en culture. • Clonage dans l’Agar, dans l’Agarose • Clonage sur méthyle cellulose • par dilution limite • par micromanipulation • par trieur de cellules

31. Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome • Clonage dans l’Agar, dans l’Agarose • on visualise directement les colonies cellulaires dans l ’agar, que l ’on remet en culture après dilution. • Clonage par dilution limite • la plus utilisée dans les laboratoires. • Réalisée directement dans une plaque de microtitration • peu onéreuse • longue, fastidieuse, laborieuse.

32. Production des anticorps monoclonaux en grande quantité • Production en en batch • flacons, ou plaques de cultures cellulaires • 40 à 100ml • rendement de de l ’ordre du µg/ml • production relativement pure • contaminant par les substituts de sérum • Techniques de microencapsulation • flacons • rendement de de l ’ordre de 0,1g/ml • exemple du procédé de la société DAMON corporation

33. Production en micro particules • Capture des hydridomes dans des billes d ’alginate • pas de contamination • purification simplifiée

34. Production en micro particules (2) • 100 mg à 1g/ml • Production industrielle possible

35. Production en ascites • Injection des hybridomes dans le péritoine de souris • Développement d ’une tumeur : ascite • Prélèvement des anticorps par ponction de liquide d ’ascite • Purification du liquide d ’ascite nécessaire • Rendement élevé 20 g/l • C’est la souris qui régule les conditions de culture !

36. Production par les bio réacteurs • Basé sur la technologie des fibres creuses. • Diminution des coûts, du temps. • Augmentation de la production 3 à 5 g/l, de la pureté • Éthiquement acceptable • Pas ou peu de contaminant (6 x moins)

37. Réacteur à fibres creuses : principe • Capillaire qui forme des fibres avec un seuil de dialyse bien calibré. • Circulation du milieu nutritif • les cellules se développent dans le milieu extra capillaire • Seuls les nutriments peuvent passer d ’un milieu à l ’autre.

38. Réacteur à fibres creuses Nutriments Cellules Métabolites Anticorps Oxygène

39. Tec No Mouse 200 mg à qq g/mois http://www.integra-biosciences.com/e-ftecnomouse.html

40. Biovest Primer HF Production de petite quantité d’anticorps XCell De 60 à 200 g/mois http://www.biovest.com/

41. Cellex Biosciences Maximizer production de l’ordre de 5 g/mois

42. Avantages Pas d’utilisation d ’animal Production de grandes quantité d’anticorps Pas de contraintes légales à l’utilisation d’animaux Pas de personnel d’animalerie Pas de contaminant Inconvénients Tous les hybridomes ne prolifèrent pas en réacteur Nécessite l’utilisation de sérum de veau fœtal Problèmes lorsque les glycosylations sont nécessaires Productions moins concentrées. Contamination par les hybridomes morts Mab de plus faible affinité Plus chère pour de petites production Production in vitro

43. Avantages Concentration élevée en Mab Pas d’intermédiaire industriels Inconvénients Utilisation de l’animal Présence de protéines murines Contaminants Stress de la souris Production in vivo

44. Purification des liquides contenant les anticorps. • Préparation de l’échantillon • Purification principale • Chromatographie d’affinité • Affinité immunologiques • spécifique du Fc. • spécifique de l’antigène. • Chromatographie échangeuses d’ions • Chromatographie échangeuse d’anion. • L’échange de cation • Hydroxylapatite Ligand Impuretés Analyte

45. Chromatographie d’affinité Fixation Elution

46. Chromatographie d’affinité Elution par déplacement avec l’antigène libre Elution par déplacement avec un analogue

47. Critères de qualité • Spécificité • Reconnaissance d ’un seul motif épitopique • Réactions croisées, non-spécifiques. • Maintient de l ’activité après modification chimique • L'affinité • Élevée • Constante et contrôlée • Avantages de ce type de production • Constante • reproductible • Utilisation de la souris

48. Limites de ce type de production • La souris ne reconnaît pas tous les motifs antigéniques • Répertoire immunologique limité • Manifestations secondaires • Inflammation • Nécrose tissulaire … • Difficulté pour obtenir des anticorps monoclonaux humains • Immortalisation des cellules B humaines très difficile • Volet éthique de la manipulation de cellules humaines • Qualité des plasmocytes humains très variable • 109 cellules B par immunisation

49. Les anticorps recombinants Anticorps coliclonaux

50. Les moyens actuels • Immunologie fondamentale • Connaissance du génome des immunoglobulines • Génie génétique, clonage, systèmes d ’expression • E.coli sécrétion périplasmique • Levure Pichia pastoris • Cellules d’insectes • Création de banques de données de gènes d’immunoglobulines • Phage display Library • Développement de techniques d’indentification performantes • Industries pharmaceutiques et sociétés biotechnologies • Sanofi Aventis, Genovac, • FDA, AFFSAPS