基因工程（一）

1. 基因工程（一）

2. 基因工程主要内容 一、基因及基因工程概述 二、基因工程理论基础 三、基因工程工具酶 四、基因工程载体 五、目的基因的获得 六、目的基因与载体DNA的连接 七、目的基因导入受体细胞 八、重组体筛选与鉴定 九、目的基因的高效表达 十、基因工程的应用及发展前景

3. 一、基因及基因工程概述 1 基因工程的发展历程 2 基因工程的概念 3 基因工程的主要内容

4. 1 基因工程的发展历程 • 孟德尔定律：生物每一个性状都是通过遗传因子来传递的，遗传因子是一些独立的遗传单位。这样把可观察的遗传性状和控制它的内在的遗传因子区分开来了，遗传因子作为基因的雏形名词诞生了。 • 1903年萨顿和鲍维里两人注意到在杂交试验中遗传因子的行为与减数分裂和受精中染色体的行为非常吻合，他们作出“遗传因子位于染色体上”的“萨顿—鲍维里假想”。 • 1909年丹麦遗传学家约翰逊在《精密遗传学原理》一书中提出“基因”概念，以此来替代孟德尔假定的“遗传因子”。从此，“基因”一词一直伴随着遗传学发展至今。

5. 1926年摩尔根《基因论》：基因以直线形式排列，它决定着一个特定的性状，而且能发生突变并随着染色体同源节段的互换而交换，它不仅是决定性状的功能单位，而且是一个突变单位和交换单位。1926年摩尔根《基因论》：基因以直线形式排列，它决定着一个特定的性状，而且能发生突变并随着染色体同源节段的互换而交换，它不仅是决定性状的功能单位，而且是一个突变单位和交换单位。 • 1941年比德尔和塔特姆提出一个基因一个酶学说，证明基因通过它所控制的酶决定着代谢中生化反应步骤，进而决定生物性状。 • 1949年鲍林与合作者在研究镰刀型细胞贫血症时推论基因决定着多肽链的氨基酸顺序。 • 1944年艾弗里、麦卡蒂等人发表了关于“转化因子”的重要论文，首次用实验明确证实：DNA是遗传信息的载体。 • 1953年Watson和 Crick提出了DNA双螺旋结构模型。

6. 1957年Benzer以T4噬菌体作为研究材料分析了基因内部的精细结构，提出了顺反子学说。从而认为基因为DNA分子上一段核苷酸顺序，负责着遗传信息传递。1957年Benzer以T4噬菌体作为研究材料分析了基因内部的精细结构，提出了顺反子学说。从而认为基因为DNA分子上一段核苷酸顺序，负责着遗传信息传递。 • 1961年法国雅各布（F. Jacob）和莫诺（J.L. Monod）在研究大肠杆菌乳糖代谢的调节机制中发现了有些基因不起合成蛋白质模板作用，只起调节或操纵作用，提出了操纵子学说 • 1967 Nirenberg和 Khorana等破译了全部64个遗传密码。 • 1970年Temin发现逆转录酶这一成就进一步发展和完善了“中心法则”。

7. 1972年 美国P.Berg领导的研究小组完成DNA体外重组，获得了猿猴病毒SV40和λDNA的重组杂种DNA分子 1973年，S.Cohen等人成功的将外部质粒基重组导入大肠杆菌内，获得了既抗卡那霉素又抗四环素的菌落 1982年开发出第一个基因工程药物：胰岛素

8. 基因工程三大理论基础 • 遗传物质是DNA • DNA的双螺旋结构 • 遗传信息传递方式：中心法则 • 技术上的三大发明 • 工具酶 • 载体 • 逆转录酶

9. 2 基因工程的概念 • 基因工程的定义：将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作过程。

10. 遗传工程：发生在遗传过程中的自然界原本存在的导致变异的一种现象，即自然出现的不同DNA链断裂并连接成新的DNA分子，新的DNA分子含有不同于亲体的DNA片断遗传工程：发生在遗传过程中的自然界原本存在的导致变异的一种现象，即自然出现的不同DNA链断裂并连接成新的DNA分子，新的DNA分子含有不同于亲体的DNA片断 • DNA重组：根据遗传工程原理利用限制性内切酶在体外对DNA进行人工操作，即采用酶法将来源不同的DNA进行体外切割与连接，构成杂种DNA分子，在自然界一般不能自发实现。 • 克隆：同一个祖先通过无性繁殖的方式产生的后代，或具有相同遗传性性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。

11. 3 基因工程的主要内容 • 基因工程实施4个必要条件： 工具酶 基因 载体 受体细胞

12. 基因工程研究的主要内容 • 带有目的基因的DNA片断的分离或人工合成 • 在体外，将带有目的基因的DNA片断连接到载体上，形成重组DNA分子 • 重组DNA分子导入受体细胞 • 带有重组DNA分子的细胞培养，获得大量的细胞繁殖群体 • 重组体的筛选 • 重组体中的目的基因的功能表达

14. 二、基因工程理论基础 • DNA的结构与复制 • DNA的变形、复性与杂交 • RNA的转录与逆转录 • 基因的表达与调控

15. 1 DNA的结构与功能 1）DNA的分子组成与基本结构 2）DNA分子的基本机构

16. DNA的分子组成与一级结构 1）DNA的分子组成与基本结构

17. 碱基 ——嘧啶碱 ——嘌呤碱

18. 核苷： N－C键，碳环上的C1与嘧啶碱 的N1或与嘌呤碱的N9相连接

19. （3）核苷酸：戊糖羟基被磷酸化，多是5’-核苷酸。用碱水解RNA，可得到2’-与3’-核糖核苷酸的混合物（3）核苷酸：戊糖羟基被磷酸化，多是5’-核苷酸。用碱水解RNA，可得到2’-与3’-核糖核苷酸的混合物

20. 脱氧核糖核酸（DNA） （1）Chargaff法则 ——A＝T，G＝C， A＋G＝T＋C ——DNA的碱基组成具有种的特异性 （2）DNA的一级结构，形成3’,5’-磷酸二酯键

21. DNA的二级结构 DNA双螺旋模型基本特点 • 两条反向平行的多核苷酸围绕同一中心轴相互缠绕 • 嘌呤与碱基位于双螺旋的内侧，磷酸在外测 • 双螺旋的平均直径为2nm • 两条核苷酸依靠彼此之间形成的氢健相联系而结合在一起 • 碱基在一条链的顺序不受任何限制，但是两条链之间互补。

22. DNA的复制 复制方式：半保留复制， 复制的起点和过程：在特定位点（复制起始点）开始，在通常情况下，复制是双向的和对称的，每一条双链链都是由一条亲链和一条子链组成，复制高度忠实。复制在起始阶段进行控制，一旦复制开始，即继续下去，直到整个复制子（能独立进行复制的单位）完成。

23. DNA复制过程（原核生物） DNA复制叉上进行的基本活动包括 • 双链的解开 • RNA引物的合成 • DNA链的延长 • 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片断 • 切除和修复渗入DNA的脱氧尿苷酸和错配碱基

24. 真核生物的DNA复制 • 有许多复制起点 • 在全部复制完成之前，不再新的复制 • 首先复制的是常染色质细胞，然后才是异染色质 • 亲代核小体的组蛋白全保留

25. 2 DNA的变形、复性与杂交 • 核酸的变性、复性和杂交 变性：氢键断裂，形成单链，不涉及共价键 复性：两条彼此分开的链，重新缔合 核酸的杂交：异源DNA之间，或DNA与RNA之间会形成杂交

26. 3 RNA的转录与逆转录 1）RNA的结构 2）RNA的转录 3）RNA的逆转录

27. 1）RNA的结构 3核糖核酸 （1）主要由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶（U）核糖核苷酸组成 （2）RNA一级结构： • 形成于3’,5’-磷酸二酯键 • 单链线形分子，只是局部区域为双螺旋结构 （3）RNA类型： 核糖体RNA，rDNA 5S，5.8S，16S，23S 转运RNA， tDNA 4S沉降 信使RNA，mRNA 变化范围大

30. 2）RNA的转录 • RNA聚合酶 原核生物 真核生物

31. 3）转录过程 • 在体外，两条链可同时转录，在体内仅有一条链，或某些区域以这条链转录，另一条区域以另一条链转录 • 以完整双链DNA为模板，DNA链局部解开，转录后双链仍然保持双链的结构， • 转录分为起始、延长和中止三个步骤 • 合成方向5’ 3’方向

33. 3）RNA的逆转录 • 逆转录酶：研究致癌RNA病毒过程中发现 属于多功能酶： • 以RNA为模板合成DNA链，形成杂交分子 • 以新合成DNA为模板合成互补DNA链 • 具有3‘ 5’和5’ 3’核酸外切酶作用

34. 逆转录过程：致癌RNA病毒进入细胞——逆转录酶合成双链DNA（前病毒）——环化并进入细胞核——整合进宿主细胞并转录逆转录过程：致癌RNA病毒进入细胞——逆转录酶合成双链DNA（前病毒）——环化并进入细胞核——整合进宿主细胞并转录

35. 4 基因的表达与调控 • 基因的分类和结构 结构基因：决定某一种蛋白质分子结构相应的一段DNA 调节基因：带有阻遇蛋白基因，控制结构基因活性 操纵基因：与阻遇蛋白结合，结构基因无活性，当诱导物与阻遇蛋白结合，操纵基因打开控制结构基因的开关

36. 操纵子：细菌基因的表达和调控单位，包括结构基因、调节基因和由调节基因所控制的序列。操纵子：细菌基因的表达和调控单位，包括结构基因、调节基因和由调节基因所控制的序列。 • 启动子：与RNA聚合酶识别，结合和开始转录的一段DNA序列 • 中止子：提供转录停止信号的DNA序列 • 内含子：真核基因的编码区域 • 外显子：真核基因中结构基因中的非编码区域

37. 原核生物中的基因的表达和调控 • 组成型：即基因的转录、地点、水平基本不受发育阶段或组织特异性的调控，始终处于转录状态。 调控型：低分子量化合物与调控蛋白之间的相互作用，或诱导基因的转录，或抑制基因的转录，如大肠杆菌乳糖操纵子模型

39. 真核生物中基因的表达和调控 基因转录调控 • 功能有关的结构基因分布在染色体不同部位，甚至不同的染色体上 • 体内调控信号常来自体内的激素 • 真核生物存在增强子，对转录起增强作用，有时必不可少 基因翻译调控 • 形成正确的二硫键 • 切割前体 • 蛋白质糖基化 • 对氨基酸的修饰

40. 三、基因工程工具酶 • 定义：指切割DNA分子、进行DNA片断修饰和DNA片断连接等所需的酶 • 分类 限制性内切酶 连接酶 修饰酶

41. 1.限制性核酸内切酶 • 概念：主要形成于细菌内，具有极高的专一性，识别双链DNA上的特定位点，将两条链都切断，形成粘末端或平末端。 • 分类： Ⅰ类酶： Ⅲ类酶： Ⅱ类酶： • 识别特定序列，一般4～6个碱基，且大多呈二重对称，即回文序列 • 具有特定的酶切位点 • 没有甲基化修饰酶功能， 不需要ATP和SAM作为辅助因子。

43. 2.T4DNA连接酶 • 功能：不仅能在模板上连接DNA和DNA之间的缺口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。

44. 3.其它工具酶 • DNA聚合酶：DNA分子修复和体外重组 • RNA逆转录酶：组建cDNA文库 • T4多核苷酸酶：标记5’端 • 碱性磷酸酶：去处5’端防止环化，

45. 四、基因工程载体 • 基本概念 • 用于原核生物的载体 • 用于酵母宿主的载体 • 由于植物宿主的载体 • 用于动物宿主的载体

46. 1.基本概念 • 定义：与外源DNA片断结合并将之传递到受体细胞而使之复制表达的传递者 包括质粒、噬菌体和病毒等 • 载体必须具备的条件 • 易于进入受体细胞 • 在受体细胞内，载体可以独立地进行复制。即载体本身必须是一个复制单位，称为复制子。 • 易于鉴定和筛选。即容易将带有外源DNA的重组体与不带外源DNA的载体区别开来 • 对多种限制酶有单一或较少的切口，最好是单一切点

47. 2.用于原核细胞——质粒 定义：细菌染色体外的能够自我复制的双链闭合环状DNA分子 分类： ——松弛性控制质粒：不严格受宿主细胞染色体复制过程的控制，拷贝数较多，每一个细胞达10~200个 ——严紧型控制质粒：其复制受细菌染色体复制严格控制，即只有染色体本身复制时，这类质粒才复制，拷贝数很低。 基因工程中，一般采用松弛型质粒作为载体

48. 质粒载体pBR332:研究最多，最常用的一种载体。质粒载体pBR332:研究最多，最常用的一种载体。 ——4363bp ——复制起点+1个抗氨苄青霉素基因+1个抗四环素基因 ——36个单一限制性内切酶，其中BamHⅠ 、 HindⅢ和SaⅠ的切点位于抗四环素基因上，PstⅠ位于抗氨苄青霉素，易于筛选 ——容纳的外源DNA在5kb左右

49. 质粒载体pUC19 ——2686bp ——复制起始位点+1个抗氨苄青霉素基因+大肠杆菌乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因调节片断+阻遏蛋白基因 ——单一位点多 ——筛选方便：抗Ampr和颜色反应

50. 2.用于原核细胞——噬菌体 λ噬菌体： ——大小约49kb，具有粘性末端，进入细胞后变成环状 ——易于感染而进入细胞 ——通过裂解途径和溶源途径增值。 ——转化DNA片段长，能包装38～54kb，能转化5～20kb外源基因 ——限制性内切酶位点多