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CTAB 法提取植物总 DNA 专业：生物化学与分子生物学 学号： 2013211021 姓名：岳文冉. 植物 DNA 抽提的常用方法. SDS 法：过程长、纯度高 CTAB 法 ：方法简单、快速， DNA 产量高 （纯度稍次，适用于一般生物学操作） 还有试剂盒法. 实验原理. 真核生物 DNA 与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在于细胞核内。 在提取植物 DNA 时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出核蛋白。
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CTAB法提取植物总DNA • 专业：生物化学与分子生物学 • 学号：2013211021 • 姓名：岳文冉
植物DNA抽提的常用方法 • SDS法：过程长、纯度高 • CTAB法：方法简单、快速，DNA产量高 （纯度稍次，适用于一般生物学操作） • 还有试剂盒法
实验原理 • 真核生物DNA与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在于细胞核内。 • 在提取植物DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出核蛋白。 • 在浓氯化钠溶液（1~2 mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；在稀氯化钠溶液（0.14 mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。 • 利用不同浓度氯化钠溶液将DNA核蛋白或RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
CTAB法原理 • CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性，在高离子强度的溶液中（ ≥0.7mol/L NaCl ），CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可分离出核酸。 • CTAB，分子式C16H33(CH3)NBr，白色或黄色晶体或固体粉末，有刺激气味。熔点248~251℃，溶于热水、乙醇、氯仿，易溶于异丙醇水溶液，微溶于丙酮，不溶于醚。强酸强碱中稳定，耐热、耐光
2% CTAB 5%PVP 1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA 100 mmol/LTris-HCl (pH8.0) 0.2% 巯基乙醇 材料与试剂 实验材料 植物叶片 试剂 2×CTAB抽提液 （成分） 氯仿 酚：氯仿：异戊醇(25：24：1) 无水乙醇 70%乙醇
Tris-HCl (pH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏 • EDTA (螯合Mg2+，Ca2+等二价阳离子，从而抑制DNase活性) • NaCl：提供高盐环境，使DNA充分溶解在液相中 • CTAB：裂解细胞膜，使蛋白质变性，并结合核酸，形成特异的核酸-CTAB复合物，可溶于≥0.7mol/L NaCl的高盐缓冲液，利于核酸分离。 • 巯基乙醇：抗氧化剂，有效防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除； • PVP（聚乙烯吡咯烷醇），是酚的络合物，能与多酚形成不溶的络合物，减少DNA中酚的污染；同时能和多糖结合，去除多糖； • 乙醇（ Ethanol）：不与核酸反应；溶液中DNA以水合状态存在，当乙醇浓度超过67%时，乙醇夺取DNA周围的水，使DNA失水而聚合沉淀下来；
氯仿：加速有机相和液相分离； 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚； • 酚：使蛋白质变性，同时抑制DNase的降解，用苯酚处理匀浆液时，蛋白与DNA联合键已断裂，蛋白分子表面的极性基团与苯酚相似相容，蛋白质溶于酚，DNA溶于水； • 异戊醇：减少蛋白质操作过程中产生的气泡（异戊醇可降低表面张力，减少气泡产生）；有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相，中间的变性蛋白相，下层有机溶剂相维持稳定； • Na+：用乙醇沉淀DNA时，溶液中加入单价阳离子， Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子间的同性电荷相斥力，易于聚集沉淀。
基本过程 细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸
四、操作步骤 1. 取拟南芥新鲜叶片100mg，在液氮冷冻条件下研磨成粉末; 2. 加入0.6ml的2×CTAB提取液，振荡摇匀（vertex），65℃水浴30 min（30-60min），每10 min颠倒混匀一次; 破碎细胞 3. 取出离心管，冷却后加入0.6 ml酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀； 抽提去蛋白 4. 11500 rpm，室温离心10min；将上清转移至另一1.5 ml 离心管中；（约500 ul，根据情况而定） 5．加等体积氯仿震荡混匀，11500 rpm离心10 min，取上清；(约400-450 ul) 再次抽提去蛋白
6．加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min；沉淀核酸6．加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min；沉淀核酸 7. 4℃，15800g（rcf）离心20min，弃上清，70% 冰乙醇洗两次； （加入70% 冰乙醇，将沉淀吹打弹起） 8. 7000g常温离心3min，弃上清吸干乙醇，通风橱内干燥至无色透明； 9．乙醇充分挥发后，加入20ug/ml的RNase 20ul，混匀，37℃水浴30min；去除RNA 10. 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、质量： 1ulDNA样品+1ul 6×loading buffer+4ul ddH2O
常用电泳缓冲液 • Tris-硼酸（TBE） • Tris-乙酸（TAE） • Tris-磷酸（TPE）
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 • 上样缓冲液
琼脂糖凝胶制作过程 实验步骤： 1）组装好制胶模具，水平放置。 2）将琼脂糖和电泳缓冲液按质量体积百分比配成一定浓度的胶。微波炉加热至全熔。 3）等凝胶温度降到50-60度以下时，加入溴乙锭至终浓度为0.5ug/ml，摇匀并倒入水平板，胶厚约0.5cm，除掉气泡，插入样品梳。 4）凝固后，将梳子轻轻拔出。将平板放入电泳槽，加入缓冲液至高于胶面约1mm. 5）在胶两边的样品孔中加入DNA分子量标准（DNA Marker），中间加入样品，盖上盖子，在1-10V/cm的电压下电泳。 6）当示踪染料迁移至足以分离DNA片段的距离时，电泳结束。样品在紫外灯下观察、成像。
定 量 • 常用260nm与280nm处的吸光值比值来确定： • DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处 • 纯的dsDNA的A260／A280为1.8 • 纯RNA的A260／A280为2.0 • 若DNA样品的A260／A280>1.8，则表明有RNA污染 • 若DNA样品的A260／A280<1.8，则表明有蛋白污染 • 若RNA样品的A260／A280<2.0，则表明有蛋白 污染 • 若RNA样品的A260／A230<1.8，则表明有 EDTA 、多糖、酚类、肽、盐酸等其他杂质 污染（正常值为2.0-2.2）
五、注意事项 （1）选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀； （2）若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2-5％），尽可能选取幼嫩的材料； （3）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须 采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。
