Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal.
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Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal. Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal. Formas de actuación mediante terapia génica. Mecanismos de introducción del gen terapéutico. Terapia génica “in vivo” y “ex vivo”. Ingenieria Tisular.

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Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal.

  • Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal.

  • Formas de actuación mediante terapia génica.

  • Mecanismos de introducción del gen terapéutico. Terapia génica “in vivo” y “ex vivo”. Ingenieria Tisular.

  • Enfermedades candidatas para un tratamiento con terapia génica.


¿QUÉ es la Terapia génica? animal.

“Proceso por el cual un nuevo gen es introducido en células de un individuo para producir un efecto terapéutico.”

DNA como medicamento

o Curar con genes


¿QUÉ es Gene Marking? animal.

“Proceso que utiliza técnicas comunes a la Terapia Génica pero sin buscar un efecto terapéutico.”

Ej. Seguir la pista a determinadas

células en el organismo.


“Añadir función” animal.

Terapia Génica

“Suprimir función”


“Añadir función” animal.

Terapia Génica


Añadir función animal.

  • Sustitución del gen deseado.

  • Reparación de una mutación.

  • Añadir un gen


Añadir función animal.

  • Recombinación homológa (sustitución o reparación puntual)

  • Introducción del transgen al azar

    (añadir un gen)


Terapia Génica animal.

“Suprimir función”


Suprimir función animal.

  • Muerte celular (suicidio de las células)

  • Oligonucleótidos antisentido (expresión).

  • Ribozimas (Ruptura).


OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO animal.

iRNA: RNA de interferencia



“In vivo” animal.

Terapia Génica

“Ex vivo”


IN VIVO/EX VIVO animal.

DIRECTAMENTE EN EL INDIVIDUO ADULTO

REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES

EX VIVO

SOLO EN CULTIVOS CELULARES


IN VIVO/EX VIVO animal.

DNA desnudo

  • DIRECTOS

EX VIVO


DNA desnudo animal.

  • Inyección de la molécula de DNA.

  • Músculo , Piel, Mucosas y Timo.

  • Introducción por “nuclear pore complex”.

  • Talla ILIMITADA.

  • Bajo porcentaje de transfección

  • No hay integración en el genoma.

  • No hay amplificación del DNA.


IN VIVO/EX VIVO animal.

DNA desnudo

  • DIRECTOS

  • INDIRECTOS

-

Mediados por vectores

EX VIVO


¿Qué es un vector? animal.

  • “Son sistemas que ayudan en el proceso de transferencia de un gen exógeno a la célula, facilitando la entrega, biodisponibilidad intracelular del mismo de modo que pueda funcionar correctamente”


Características del vector ideal animal.

  • Especificidad de órgano o tejido.

  • Protección del DNA.

  • Elevada disponibilidad.

  • Expresión eficaz.

  • No inmunógeno/sin repuestas inflamatorias.

  • Seguro paciente/entorno.


IN VIVO/EX VIVO animal.

DNA desnudo

  • DIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos específicos

  • INDIRECTOS

EX VIVO


Una cadena de RNA. animal.

Protegidos por una cápside.

Talla de 80 a 130 nm.

Tres genes importantes:

gag: proteínas de la cápside

pol: transcriptasa inversa e integrasa

Env: proteínas de envoltura y reconocimiento de receptor

Zonas LTR: Long Terminal Repeat

VECTORES RETROVIRALES


LTR----GAG/POL--ENV----LTR animal.

LTR----PROMO+GEN----LTR

Construcción Retroviral

MMLV: Moloney Murine Leukemia Virus


CÉLULAS EMPAQUETADORAS (helper free) animal.

RNA

LTR---GEN---LTR

Producción de vectores retrovirales

-------GAG/POL--ENV-------


Retrovirus Recombinantes animal.

Producción de vectores retrovirales

CÉLULAS EMPAQUETADORAS (helper free)


Alta eficacia de transducción. animal.

Tamaño del inserto 8Kb.

Alta expresión una vez introducido en el genoma.

Sistema muy bien estudiado.

Proteínas del vector no se expresan en el huésped.

Necesita células en división.

Se consiguen títulos muy bajos de virus.

Integración al azar en el genoma.

Transducción “in vivo” poco efectiva.

Características de los

vectores retrovirales


IN VIVO/EX VIVO animal.

DNA desnudo

  • DIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos específicos

  • INDIRECTOS

EX VIVO


DNA lineal de cadena doble. animal.

Más complejos que los retrovirus.

Tres genes importantes:

E1: rescata células de la quiescencia.

E2: proteínas relacionadas con la replicación del DNA.

E3: defensa ante el sistema inmunitario.

E4: regulación de la transcripción.

VECTORES ADENOVIRALES

VIRUS RECOMBINANTES E1 Y E3 ELIMINADOS


Eficaces a la hora de transferir el gen episomal a una gran cantidad de células.

Fácil producción en el laboratorio.

Gran respuesta inmunitaria.

Dificultad para repetir la inyección de virus.

Características de los

vectores adenovirales


IN VIVO/EX VIVO cantidad de células.

DNA desnudo

  • DIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos específicos

  • INDIRECTOS

EX VIVO


DNA lineal de cadena doble. cantidad de células.

Se insertan en el genoma.

Dos genes :

rep: replicación e integración del virus.

cap: tres proteínas estructurales víricas.

TR: repeticiones terminales-145 nucleótidos.

VECT. ADENOASOCIADOS

VIRUS RECOMBINANTES SOLO CONTIENEN TR

Células que poseen los genes rep y cap.


Expresión a largo plazo. cantidad de células.

No hay respuesta inmunitaria.

Talla limitada del gen a introducir (aprox 5 Kb).

Dificultad para obtener grandes cantidades.

Características de los

vectores adeno-asociados


http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htmhttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm


IN VIVO/EX VIVOhttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

DNA desnudo

  • DIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos específicos

  • INDIRECTOS

EX VIVO


LIPOSOMAShttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

  • CATIÓNICOS

    • Su carga positiva reacciona con la negativa del DNA formando un complejo.

  • pH SENSIBLE O ANIÓNICO

    • Mediante una desestabilización por bajo pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”.

POSIBILIDAD DE UNIR RECEPTORES

ESPECÍFICOS


Protegen al DNAhttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

No hay limite de tamaño

Enviar a lugares específicos.

Baja eficacia

Expresión transitoria.

Toxicidad celular

Inhibición por componentes séricos.

Características de los liposomas


IN VIVO/EX VIVOhttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

DNA desnudo

  • DIRECTOS

- Retrovirus

-Adenovirus

- Adenovirus asociados

- Liposomas

- Fragmentos específicos

  • INDIRECTOS

EX VIVO

Precipitación con

fosfato de calcio

  • QUIMICOS

Electroporación

  • FISICOS


MÉTODOS “EX VIVO”http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

(Cultivos celulares)

Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente en el enfermo


MECANISMO “EX VIVO”http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm


MODO DE INTRODUCCIÓNhttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm


Algunas...http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

  • Enfermedades monogénicas.

  • Cancer.

  • Enfermedades infecciosas o parasitarias.

  • Enfermedades neurodegenerativas


Enfermedades Monogénicashttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

- Conocidas por la mayoría como las únicas candidatas para el tratamiento.

- Aporte de la proteína/enzima deficitaria.

- Posibilidad de realizar terapia génica germinal..


Algunas...http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

Deficiencia Inmune Severa Combinada

Deficiencia Inmune Severa Combinada ligada al cromosoma X

Fibrosis Quística

Enfermedades lisosomales (Gaucher, etc.)


Deficiencia Inmune Severa Combinadahttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

- Deficiencia en la enzima Adenosin Desaminasa.

- 1/100.000 (25% de mortalidad).

- Fragilidad de los linfocitos T..

INMUNOSUPRESION


David "niño burbuja", http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

(Fuente: M.R. Cummings. Herencia humana (3ª ed.), Interamericana (1995)


Tratamientoshttp://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm

- Aportación de la enzima recombinante:

ADA

PEG-ADA

- Transplante de médula osea.


1ª Experiencia de Terapia génica: Deficiencia Inmune Severa Combinada

- 1990. Dr Blaese (EEUU)

Dr. Bordignon (Italia)

-1995 Demuestran la eficacia del tratamiento


Ashanti de Silva tratada a los cuatro años de edad. Severa Combinada

(Fuentes: W.F. Anderson, Scient. Amer., 273(3):96-98(1995).


X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada Severa Combinada

-Mutación en el Cromosoma X

- Deficiencia en la cadena g del receptor para la interleukina IL2RG

- Hospital Necker de Paris (11 niños)


X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada Severa Combinada

  • 3 de los niños sufrieron una leucemia.

  • ¿Por qué?

    • Efecto posición (LMO2)-2003

    • Efecto sobreexpresión- 2006


Fibrosis Quística Severa Combinada

- Deficiencia en el CTFR (Cystic factor transmembrane receptor).

- 1/2.800 (Muerte a los 29).

- No hay tratamiento.

Problemas para clonar el CTFR


2.-Tumores Severa Combinada

- - Muerte celular

- Genes supresores de tumores.

- Producción de linfoquinas

- Inmuno Terapia con antígenos MHC

Los más tratados:

Melanoma.

Leucemias Glioblastoma

Tumores de pulmón, hígado, etc.


3.- INFECCIOSAS Y/O PARASITARIAS Severa Combinada

- - Estimular el sistema inmunitario.

- Vacunas de DNA desnudo con antígenos.

- Linfocitos recombinantes para los anticuerpos que actuan contra el virus.

Algunos ejemplos:

SIDA

Vacunas de DNA desnudo en animales.


4.- Enfermedades neurodegenerativas Severa Combinada

- - Inhibición de apoptosis neuronal.

- Producción de L-dopa o factores neurotróficos en cerebro.

Algunos ejemplos:

Enfermedades de la motoneurona

(E.L.A. Y E.M.)

Parkinson y Alzheimer.


ENFERMEDADES TRATADAS Severa Combinada


¿FASES? Severa Combinada



CIFRAS POR PAISES Severa Combinada


CIFRAS POR CONTINENTES Severa Combinada


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