פרק 8 : הנדסת תאים ואורגניזמים לצורכי מחקר וליישומים ביוטכנולוגיים

1. פרק 8 : הנדסת תאים ואורגניזמים לצורכי מחקר וליישומים ביוטכנולוגיים • חשיבות ההנדסה הגנטית : • הנדסה גנטית משמשת בעיקר לחקר תפקיד גנים. • משמשת לייצור תרופה המתבססת על תפקיד הגנים. התרופות הן חלבונים רקומביננטיים המיוצרים בייצור-יתר למטרות רפואיות. • השבחת אורגניזמים לתועלת האדם (בע"ח, צמחים). יישומים ביוטכנולוגיים של הנדסה גנטית דורשים התקדמות בשלושה מסלולים: מסלול א' : "מ DNA - לגן משובט" - שיבוט גנים חשובים מ DNA . מסלול ב' : מגן- לקביעת תפקידיו של גן" . קביעת תפקידיו של הגן המשובט ע"י ייצור-יתר או השתקת הגן. חקר שינויים בהתנהגות ובתפקוד התא במצבים של עודף ביטוי ובמצבים של השתקת ביטוי מגדירים את תפקיד הגן בתא ובאורגניזם השלם. מסלול ג' : "מתפקידיו של גן - ליישומים ביוטכנולוגיים" .

2. ביוטכנולוגיה מודרנית מבוססת על DNA רקומביננטי + יישום כלכלי הרעיון הראשון : לייצר בחיידק , בעזרת דנ"א רקומביננטי, חלבונים של אדם בעלי ערך רפואי ושיווקי. משבצים בתוך נשא (פלסמיד) DNA המקודד לחלבון אדם בסמוך ל DNAהמכיל אזור בקרה של חיידק ומבצעים טרנספורמציה של חיידקים עם הפלסמיד הרקומביננטי והחלבון האנושי יתבטא בחיידקים. אינסולין אדם, הורמון גדילה אנושי וסומטוסטטין היו החלבונים הראשונים שיוצרו בחיידקים. יישום ביוטכנולוגי מבוסס על שלושה מסלולים: מסלול ב' מסלול א' קביעת תפקידיו של גן DNA גן משובט פרקים 5, 7 - 8 פרקים 2 - 6 פרק 8 מסלול ג' יישומים ביוטכנולוגיים מבוססי הנדסה גנטית

3. הגברת ביטוי גנים בתאים של בע"ח ייצור-יתר של חלבוני אדם בתאים של בע"ח למטרות רפואיות . הורמון אריתרופוייטין מיוצר בעודף בתאי יונק בתרבית. הגן הוחדר בעזרת פלסמיד לתאים בתרבית. כיום מייצרים כ 30 חלבונים של אדם המשמשים תרופות : הורמונים, גורמי גדילה, וחלבונים המווסתים את מערכת החיסון. גן החשוב מבחינה רפואית - זהו גן שניתן לווסת את ביטוי התוצר שלו בתא , ואת כמות התוצר שלו בגוף . הגברה או השתקה של הגן יביא לשיפור במצבו הרפואי של החולה. • ביטוי-יתר של תוצר גן בתאים של בע"ח בתרבית • במצב ביטוי-יתר כופים על התא לייצר כמות גדולה (עודף) של תוצר הגן RNA , חלבון. • משבטים את הגן או DNA-משלים של הגן בתוך נשא-ביטוי, זהו פלסמיד בעל אזור בקרה חזק הממוקם בסמוך ל DNA-משלים או לגן. • הנשא הרקומביננטי מוחדר לתאים. גורמי תעתוק של התא נקשרים לאתר הבקרה ומתקבל ביטוי-תר של הגן. בודקים את תגובת התא לביטוי-יתר של החלבון. לפי תפקוד התא קובעים את תפקידי הגן. • הגברה סלקטיבית של ה DNA הרצוי ע"י שיבוט DNA-משלים בשיטת RT-PCR על תבנית RNA-שליח מתאים שבהם הגן מתבטא. הגברה סלקטיבית נקבעת ע"י שימוש בתחלים הנגזרים מה DNA הרצוי.

4. שיבוט באמצעות "PCR מוסיף אתרי הגבלה" אם בקצוות של מקטע ה DNA שאותו רוצים לקשור לנשא אין אתרי הגבלה מתאימים לשיבוץ בנשא משתמשים ב "תחלים מיוחדים". "תחלים מיוחדים" : בתחלים יש רצף הנגזר מה DNAהקובע את גבולותיו לצורך ההגברה ובצמוד לו רצף אתר הגבלה הממוקם בקצה התחל (תוספת מלאכותית ). • החדרת הנשא הרקומביננטי לתאי בע"ח לצורך ביטויו ע"י טרנספקציה. • בתהליך הטרנספקציה נעזרים להחדרה יעילה בתרכובות כימיות כמו סידן פוספט. התרכובות פוערות חורים בקרום התא שמאוחר יותר עוברים איחוי בחזרה. • דרך נוספת, אלקטרופורציה. באמצעות זרם חשמלי פוערים פתחים בקרום התאים להחדרת ה DNA. • בתוך התאים נשא-הביטוי הרקומביננטי מאפשר ביטוי -יתר של RNA והחלבון . ביטוי-יתר מתאפשר כי הנשא מכיל אזור בקרה "חזק" הקושר ביעילות רבה את גורמי התעתוק. • אחוז התאים שקלטו DNAבטרנספקציה מזערי ( 1% – 10% מהתאים בלבד) תלוי בסוג התא ובשיטת ההחדרה. • ה DNA שחדר לתא צריך לחדור לגרעין. בגרעין מתאפשר ביטוי זמני של תוצרי הגן ( RNA ובהמשך חלבון) כי ה DNA מתפרק לאחר מספר ימים. באחוז קטן מהתאים מצליח תהליך שיבוץ ה DNA בגנום התא (פירוק ה DNA נמנע) לאורך זמן בתא ומתאפשר ביטוי קבוע ויציב של הגן. בחלוקת התא יעבור הגן בתורשה לתאי הבת. במצב זזה ניתן לבדוק השפעת ביטוי היתר על התנהגות ותפקוד התא.

5. השתקת ביטוי גנים בתאים של בע"ח השתקת גנים תורמת להבנת תפקיד הגנים בצורה משמעותית. ביטוי-יתר של גן לא תמיד מלווה בשינויים נראים לעין בהתנהגות התא.השתקת ביטויי הגנים משלימה את הבנת התפקיד. נטרול הביטוי של גן : מתבצע ברמת DNA ע"י שיבוש רצף הגן בתא בתרבית או בתא עוברי. מחליפים מקטע מקורי של הגן במקטע זר מנטרל. ניסוי בעכברים הראה: שיבוש גן בתא עוברי של עכבר , השיבוש היה בכל תאי גופו. כך ניתן ללמוד על תפקיד הגן . שיבוש גן ברמת DNA קשה לביצוע ונדיר. לכן שיבוש ביטוי ברמת RNA –שליח נפוץ יותר. השתקתהביטוי של גן : נעשית ברמת RNA-שליח בתרבית תאים ע"י RNA-מפריע . זהו RNA בעל רצף משלים לרצף RNA-שליח של הגן , נצמד אליו , מפריע ומשתק את תרגומו לחלבון או שגורם להרס השליח. זו השתקה סלקטיבית וממוקדת של השליח. • שימוש בסוגי RNA-מפריע להשתקת גנים : • שימוש ב RNA מפריע טבעי הקיים בתא מסוג : RNA anti-sense ( RNA חסר משמעות). זהו RNA שלא מקודד לחלבון , בעל רצף משלים ל RNA sense (RNA משמעותי יוצר חלבון). שני סוגי הRNA תועתקו ונוצרו משני כיוונים שונים של אותו מקטע DNA המקודד לחלבון. שני סוגי ה RNA נוצרו מגדילים שונים. כל סוג תועתק מגדיל אחר של מקטע ה DNA. שני סוגי ה RNA יכולים להיצמד אחד לשני בגלל רצף משלים וליצור RNA דו-גדילי. ה RNA הדו-גדילי נהרס בתא וה RNA-שליח לא יוצר חלבון. זו השתקת ביטוי גן.

6. משנת 1998 משתמשים ב RNA מפריע , דו-גדילי , קטן , סינתטי , המוחדר מבחוץ לתוך התא, והוא יעיל פי 10 יותר בהשתקת ביטוי של גן. ( פרס נובל 2006) הנקרא : siRNA ( small interfering RNA ). גודלו 22 זוגות בסיסים ובעל רצף המשלים לרצף RNA-שליח ספציפי, ומוחדר לתא בטרנספקציה. siRNA מוחדר לתא וגדיל אחד שלו מתמקם בתוך קומפלקס חלבוני ייחודי שבוו מתמקם גם ה RNA-שליח של הגן. נוצר RNA דו-גילי בתוך הקומפלקס החלבוני שעובר פירוק וה RNA-שליח מתפרק. • דוגמאות לתחומי שימוש ב RNA קטן ומפריע : • חקר חשיבות גן p53 המקודד לחלבון p53המדכא סרטן. ביטוי יתר של חלבון זה בתא סרטני או בריא גורם למות התא. שימוש ב RNA קטן ומפריע השתיק את ביטוי הגן והקטין את כמות החלבון בתאים שנחשפו לסטרס של קרינה חזקה. התאים לא מתו. מכאן שתפקיד הגן (או החלבון ) p53 הוא לגרום למות התא בעיתוי מסוים של סטרס. הסתבר שחלבון זה מהווה גורם תעתוק הנקשר לאזורי הבקרה של גנים שיש להם תפקיד בגרימת מוות מתוכנן (אפופטוזיס) ולהתאבדות התא. • ריפוי גני. במחלות של ביטוי יתר של חלבון הגורם למחלה כמו חלבוני אלרגיה , חלבונים היוצרים כלי דם להזנת גידול סרטני. • נשק נגד וירוסים באדם ובצמחים. ניתן להחדיר לDNA של תא מקטע DNA המקודד עבור RNA קטן ומפריע. כך שהתא יצור אותו בעצמו. תרופה נגד HIV גורם למחלת איידס. רצף RNA של הנגיף ידוע לנו. התקווה שניתן יהיה להשתיקו ע"י siRNA .

7. ביטוי יתר של תוצר רצוי בבע"ח טרנסגניים חלבונים רבים המופרשים ע"י התא פועלים על תאים אחרים. לכן חשוב לחקור ביטוי-יתר בגוף בע"ח ( In Vivo ) ולא רק בתרבית תאים במבחנה/צלחת ( In Vitro ). חשוב לבדוק תפקידי חלבון בהקשר תהליכים התפתחותיים, תהליכים התנהגותיים ועמידות למחלות באורגניזם השלם. ביטוי יתר של החלבון באורגניזם השלם (עכבר) יאפשר מחקרים אלה. מזריקים כ 500 עותקים של גן שמוקם בסמוך לאזור בקרה חזק רצוי לתוך ביצית עכבר מופרית. בביציות אחדות ישתבץ הגן בגנום הביצית. מחדירים את הביציות האלה לעכברה פונדקאית. בחלק מהצאצאים הנולדים יימצא הגן בכל תאי הגוף של הילוד. בע"ח הנושא בכל תאיו גן שהוחדר מבחוץ נקרא : "בע"ח טרנסגני". הגן המוחדר נקרא : "טרנסגן" והוא מועבר בתורשה. הטרנסגן מתבטא בעודף. ניתן לבחור בסוג של אזור בקרה המאפשר ביטוי סלקטיבי ברקמה מסוימת (או איבר מסוים) בלבד. כך יצרו עכברים טרנסגנים להורמון הגדילה (1982). מאוחר יותר יצרו דגים טרנסגנים (1992) עם ביטוי יתר של הורמון הגדילה. חששות: אכלת דגים אלה עם הורמון הגדילה ??, חשש אקולוגי בטבע . התמקדות: בעמידות דגים טרנסגנים למחלות (שיקול כלכלי-שיווקי). התמקדות נוספת: בע"ח טרנסגניים יצרני תרופות (שיקול רפואי ). דוגמה- חלבון רקומביננטי נוגד קרישת דם (אנטי-תרומבין). בעבר: יוצר בתאי אוגר בתרבית. חיסרון: כמויות ייצור קטנות. תהליך ניקוי מורכב. עלויות גבוהות. כיום: מיוצר בהנדסה גנטית ושיבוט הגן, בבלוטות החלב של עז טרנסגנית. היתרון: כמויות גדולות , מופרש אל מחוץ לתא וקל להפקה.

8. הנדסה גנטית בצמחים ויסות ביטוי גנים בתאי צמחים ע"י ייצור -יתר או ע"י השתקת גנים באמצעות RNA-קטן מפריע לצורך חקר תפקידיו של גן תא או בצמח השלם. בעקבות חקר תפקידיו של הגן ניתן לנצלו ליישום ביוטכנולוגי כמו השבחת צמחים אחרים. הטרנסגן לא חייב להיות ממקור צמחי. בעקבות החדרת מקטע DNA יתקבל צמח טרנסגני בעל תכונות משופרות. לדוגמה: עמידות לתנאים קיצוניים, עמידות למחלות , למזיקים, לחומרי הדברה...

9. הנדסת צמחים בתרביות תאים תרבית צמחים משמשת לרבייה אל-מינית של הצמח בדומה לייחור המתפתח לצמח שלם. תרבית רקמה צמחית מתמיינת ומתפתחת מתא או מאיבר צמחי, בתנאי מעבדה מבוקרים, ללא תלות בתנאים חיצוניים ומתקבל צמח שלם. דסקיות עלים או פרוטופלסטים (תאי צמח ללא דופן) במצע מזון מוצק בתרבית רקמת קאלוס גוש תאים לא ממוינים הגדל בצורה לא מאורגנת מתרחשת חלוקת תאים הוספת הורמונים צמחיים התמיינות רקמת קאלוס לשורשים, עלים וגבעולים צמח שלם משוחזר מתרחשת רגנרציה

10. חיידק האגרובקטריום – מהנדס גנטי בטבע חיידק קרקע המדביק תאי צמח בטבע ומחדיר לתוכם מקטע DNA (תגלית 1970). החיידק יוצר בצמח דו-פסיגי עפץ ,שהוא גידול המתפתח מהתרבות בלתי מרוסנת של תאי הצמח. החיידק נמשך לאזור פצע בצמח ומחדיר דרכו את ה DNA המסרטן. תאים שנלקחו מהעפץ גדלים בתנאי תרבית, ללא צורך בהורמונים, אך אינם מתמיינים. תאי העפץ, בשונה מתאים בריאים, מייצרים אופינים (תרכובות חנקן), המשמשים מזון לחיידק. מנגנון ההתמרה: חיידק האגרובקטריום מזן מסרטן צמח, מכיל בתוכו פלסמיד גדול פי 10 מפלסמיד רגיל. זנים שלא מסרטנים לא מכילים את הפלסמיד. מכאן, שהפלסמיד הוא הגורם המסרטן. כאשר הוציאו את הפלסמיד מתא החיידק ( ע"י חום) שללו ממנו את יכולתו לסרטן צמח. הפלסמיד המסרטן נקרא: pTi . מקטע DNA הנקרא T - DNA מועבר מפלסמיד האגרובקטריום pTi , ע"י החיידק לתאי הצמח , חודר לגרעין תא הצמח , משתבץ בגנום התאועובר בתורשה לתאי הבת. מקטע נוסף בפלסמיד pTi, הנקרא VIR , נחוץ להעברת מקטע T - DNAלתאי הצמח.

11. הרעיון: לנצל את החיידק אגרובקטריום להחדרת DNA רצוי לתאי צמח לצורך הנדסת צמחים. פלסמיד pTi מכיל מקטע T – DNA ומקטע VIR . במקטע T – DNAיש גנים המקודים להורמונים צמחיים הגורמים לחלוקה בלתי מרוסנת של התאים וליצירת הגידול וגם הגנים המקודדים לאופינים. במקטע VIR יש גנים המקודדים לחלבונים המאפשרים החדרת מקטע T – DNAלתאי הצמח. בקצוות מקטע ה T – DNAיש רצפי DNA חשובים המשמשים "גבולות" למקטע. בתהליך ההעברה נחתך ה DNA ברצפים אלה. • כדי לנצל את פלסמיד החיידק אגרובקטריום להנדסת צמחים : • יש להקטין את הפלסמיד המכיל את מקטע T – DNAע"י יצירת שני פלסמידים קטנים. פלסמיד אחד המכיל את T – DNAוהפלסמיד השני (פלסמיד עוזרpVIR) מכילאת מקטע VIR במטרה להקל על העברת T – DNA לתאים. • הפלסמיד המכיל מקטע T – DNAנקרא פלסמיד מעביר . מקטע T – DNA יכיל את הגן הרצוי ויהווה T – DNAרקומביננטי. • T – DNAרקומביננטי : • לא יכיל גנים היוצרים עפץ. • יכיל אתרי הגבלה לשיבוץ גן רצוי לתוך ה T – DNA. • יכיל אתרי עמידות לאנטיביוטיקה קנמיצין לסלקציה המאפשרת גידול בתרבית בלעדי של תאים טרנסגנים.

12. תהליך יצירת צמח טרנסגני : • במבחנה מייצרים פלסמיד מעביר רקומביננטי ופלסמיד עוזר. • מחדירים את הפלסמיד הרקומביננטי לחיידק אגרובקטריום שכבר מכיל בתוכו את הפלסמיד העוזר. נוצר חיידק אגרובקטריום מהונדס. • מוסיפים את החיידק המהונדס לתאי צמח בתרבית. • החיידק מעביר את מקטע T-DNA הרקומביננטי המכיל את הגן הרצוי ואת גן העמידות לאנטיביוטיקה קנמיצין לתא הצמח. • מקטע זה יחדור לגרעין התא וישתלב בגנום התא הצמחי ויתבטא בו. • מוסיפים קנמיצין למצע התרבית. רק תאים טרנסגנים ישרדו ויתרבו. • מתפתח צמח טרנסגני שבכל תאו יש את הגן הרצוי. החיסרון של השיטה: אגרובקטריום מהונדס יכול להדביק רק צמחיים דו-פסיגיים. השימוש בו בצמחים חד-פסיגיים (דגנים) מוגבל. יש צורך בדרכים חלופיות. שימוש בירי של חלקיקים מיקרונים : כדורים המצופים ב DNA באמצעות תותח גנים. לאחר שהדנ"א חדר לתאים מקבלים ביטוי זמני , ורק בחלק קטן של התאים משתבץ בגנום התא. תאים אלה הם טרנסגנים , בהם יש ביטוי קבוע, וישרדו במצע המכיל קנמיצין. תאים אלה מתמיינים ויוצרים צמח טרנסגני.

13. יצירת צמחים טרנסגניים מהונדסים לשימוש חקלאי וביוטכנולוגי שיטת החדרה ישירה של גן רצוי ע"י תותח גנים היורה כדורים מצופים בדנ"א של הגן שיטת החדרה עקיפה של גן רצוי ע"י הדבקה בחיידק אגרובקטריום מהונדס המכיל את שני הפלסמידים מצפים כדורי מתכת בגודל מיקרון בדנ"א המיועד להחדרה (שמחובר לו גן העמידות לאנטיביוטיקה) ויורים אותם מתוך מיכל (תותח) בלחץ חזק. הכדורים חודרים ישירות לתאי הצמח. חותכים דסקיות עלים של צמח ושמים בצלחת תרבית עם מצע בררני (מכיל אנטיביוטיקה) מדביקים את תאי העלים בכל דסקית בחיידקי אגרובקטריום מהונדסים המכילים את שני הפלסמידים מלאכותיים זורעים את תאי הצמח שקלטו את הכדורים עם הדנ"א על מצע בררני (מכיל אנטיביוטיקה)בתרבית בתרבית מתפתחת מכל דסקית של עלה רקמת קאלוס העמידה לאנטיביוטיקה והמכילה את הגן הרצוי+ פרומוטר +גן מדווח בתרבית מתפתחת רקמת קאלוס העמידה לאנטיביוטיקה והמכילה את הגן הרצוי+ פרומוטר +גן מדווח מוסיפים לתרבית הורמונים צמחיים מתפתח צמח בוגר טרנסגני-מהונדס גנטית