5.lekcija

1. 5.lekcija MĀTESAUGA SAGATAVOŠANA, IEVADĪŠANA AUDU KULTŪRĀS

2. Mikroklonālās pavairošanas darba posmi: • 1.kultūras ievadīšana in vitro, • 2.dzinuma ataudzēšana, • 3.pavairošana (kas savukārt mijas ar dzinumu ataudzēšanu), • 4.uzglabāšana (ja tas nepieciešams), • 5.dzinuma “sagatavošana” apsakņošanai,apsakņošana, • 6.reģenerantu izstādīšana substrātā un pieradināšana ex vitro apstākļiem (daļai kultūru apsakņošana veicama šajā etapā).

3. 5.1. Ievadīšana audu kultūrās sastāv novairākiem teorētiskā un praktiskā darbaetapiem: • 1.atbilstošā laika noteikšana optimālai eksplanta noņemšanai, • 2.mātesauga izvēle, • 3.mātesauga sagatavošana, ja tas ir nepieciešams, • 4.mērķiem atbilstoša eksplanta izvēle,

4. 5.eksplanta sterilizācija, sterilizējošā aģenta un sterilizācijas laika izvēle, • 6.barotnes receptūras sastādīšana kultūras uzsākšanai, • 7.nepieciešamo fizikālo faktoru nodrošināšana (temperatūra, atbilstoša gaisma vai tumsa).

5. 5.1.1. Atbilstošā laika noteikšanaoptimālaieksplanta noņemšanai • Ir svarīgi, vai mēs strādājam ar subtropu un tropu augiem – telpaugiem, vai darbojamies ar mūsu platuma grādu lakstaugiem un it sevišķi kokaugiem. • Pirmajā gadījumā nebūs tik ļoti izteikta sezonalitāte, kaut gan rudenī – īpaši oktobrī un novembrī nerekomendē neviena taksona ievadīšanu in vitro. Lakstaugiem, kas normālos apstākļos ziemo sala grādos, gadalaiks var būt, bet var arī nebūt izšķirošs, taču kokiem un krūmiem tas būs ļoti svarīgi.

6. Literatūrā tiek pieminēts, ka kokiem izdevīgākais laiks varētu būt pēc dabiskā miera perioda izbeigšanās – parasti sākot no februāra līdz marta vai aprīļa beigām. • Ceriņu ievadīšanai audu kultūrās eksplantus izdevīgāk noņemt ziedēšanas laikā vasaras sākumā. • Otrs labvēlīgais periods varētu būt vasaras otrā puse – jūlijs un augusta sākums. Tas, protams, būs atkarīgs no konkrētā taksona, kā arī no tās augu daļas, ko mēs izmantojam.

7. 5.1.2. Mātesauga izvēle Mātesaugu izvēlas pēc noteiktiem kritērijiem: • tam jābūt pēc iespējas veselam, • jāatbilst mums interesējošiem kvalitatīviem rādītājiem, • jābūt iespējami juvenīlākam.

8. Problēma lielākoties sākas tad, ja mums ir jāievada in vitro kokaugi. Ja mēs esam pārliecināti, ka jaunais kociņš atbilst mums interesējošiem kvalitatīviem rādītājiem, tad tas vispirms tiek iepodots un novietots siltumnīcā īpašos karantīnas apstākļos. No ārā augoša eksemplāra eksplantu neiesaka noņemt.

9. Jo jaunāks koks, jo vieglāk tas padodas ievadīšanai in vitro. Ja mums interesē augstas kvalitātes īpatņa atlase un pavairošana, tad to var izdarīt tikai ar pieaugušu koku, kas ražo sēklas. Savukārt ievadīšanai audu kultūrās tas var būt jau stingri par vēlu.

10. 5.1.3. Mātesauga sagatavošana Ne vienmēr mātesaugi ir īpaši jāsagatavo. Tomēr apskatīsim piemērus, kad tas dažādu iemeslu dēļ ir jādara.Ieviešot augus in vitro, eksplanti var iet bojā ()no to fenolu oksidēšanās, kas rodas no griezuma vietā bojātām šūnām. Rezultātā rodas hinoni, kas nokrāso barotnes. To polimerizācija ar proteīniem augu audos (Loomis, Battaile, 1966) izraisa augšanas inhibēšanu vai eksplanta bojāeju daudziem augu taksoniem.

11. Lerch 1980.g. skaidrojis reakciju: polifenoloksidāze katalizē fermentu tirozināzi, kas ir atbildīga par o-difenola oksidēšanos par o-hinonu. • Lai limitētu fenolu oksidēšanos, lieto dažādus paņēmienus vai nu eksplanta (skat. 5.1.5.) vai arī mātesauga apstrādē.

12. Zinātnieki T.R.Marks un S.E.Simpson (1990) no Lielbritānijas veikuši eksperimentus ar vairākām kultūrām, • kā Hamamelis mollis ‘Pallida’, Garrya elliptica ‘James Roof’, Acer platanoides ‘Crimson King’ un Quercus robur ‘Fastigiata’, • kam fenolu izdalīšanās no eksplanta ir ļoti būtisks metodisks šķērslis.

13. Autori konstatējuši, ka fenolu zaudējumi var būt novesti līdz minimumam  vai likvidēti, • ja mātesaugus pirms eksplantu noņemšanas vai nu pilnīgi aptumšoja, • vai arī sedza ar tādu materiālu, kas laida cauri 1% no dienas gaismas. • Iniciālā fāzē in vitro tumsa neaizkavēja fenolu oksidēšanos eksplantā, bet tā pastiprināti aizkavēja oksidēšanos jau tādos Hamamelis mollis un Garrya elliptica eksplantos, kas bija saņēmuši samazinātu apgaismojumu.

14. R.L.M.Pierik (1980) eksplantus noņēmis no 8-10 gadus veciem Pyrus communis L. kokiem, • kas sākumā auguši atklātā laukā, bet vēlāk pārvietoti siltumnīcā 15 C. • Ja mums interesē augstas kvalitātes īpatņa atlase un pavairošana, tad to var izdarīt tikai ar pieaugušu koku, kas ražo sēklas. • Savukārt ievadīšanai audu kultūrās tas var būt jau stingri par vēlu.Ko tādā gadījumā darīt?

15. Franču zinātnieki B.Juncker un J.M.Favre 1989.g. publicējuši šādu eksperimentu, kad ņēma atvases no 100 gadus veca ozolaQuercus robur L. Francijas mežā un uzpotēja uz 2 gadus veciem augiem. • Šādi sagatavoti augi tika audzēti audzēšanas kamerā 27 2 C normālā dienas gaismā, piedodot papildus apgaismojumu, un no tiem arī ņēma eksplantus.

16. J.A.Manzanera un J.A.Pardos (1990) eksperimentos ar Quercus suber L. bez jauniem mātesaugiem mēģinājuši izmantot arī 30-40 gadīgu korķozola celmu, ko septembra mēnesī apsmidzināja ar 100 mg.L-1 BAP šķīdumu. • Pēc 3 nedēļām zinātnieki ieguvuši 2-5 cm garus dzinumus, ko izmantoja ievadīšanai in vitro.

17. Otra tipa mātesaugs bijis 75-115 gadus vecs korķozols, no kā nogriezti zari februāra mēnesī, • tad tie turēti7 dienas 4 C un • sekojoši 24 stundas turēti 1 g.L-1 fernide (fern – paparde) šķīdumā, • tad migloti ar 100 mg.L-1 BAP šķīdumu. • Pēc 6 nedēļām ieguva dažus cm garus dzinumus, ko izmantoja eksplantu noņemšanai.

18. T.R.Marks un S.E.Simpson (1990), darbojoties ar kokaugiem secinājuši, ka • pirms eksplantu noņemšanas mātesaugus bija lietderīgi profilaktiski apmiglot ar 0,2% preparātu benomilu.

19. Smagula un Lyrene (1983) publicē metodiku zileņu mātesaugu juvenilizēšanai. Šajā darbā tika lietotas divējādas apstrādes: • etiolācija, izmēģinot arī divus dažādus temperatūras režīmus, • aplikācija ar glifosfātu vai etofonu. Autori apgalvo, ka minētā metode neizsauca klonālo variāciju rašanos.

20. Arī lakstaugiem reizēm ir vajadzīga speciāla apstrāde. • Nacionālajā botāniskajā dārzā Salaspilī gerberām māteaugus iestādīja kūdras substrātā izolētā vietā tā, lai rizoma atrastos uz substrāta kā uz kalniņa; tika nogrieztas visas lapas, un visbeidzot rizoma nomazgāta un aplaistīta ar fungicīda šķīdumu. Šim mātesaugu stādījumam apkārt aplika karkasu, ko apņēma ar polietilēna plēvi. • Pēc vairākām nedēļām no rizomas meristematiskajiem centriņiem ir izveidojušies jauni dzinumi, ko izmantoja galotnes izolēšanai un ievadīšanai in vitro.

21. Nacionālā botāniskā dārza Augu audu kultūru laboratorijā pēc individuāla selekcionāru pasūtījuma tiek pavairotas jaunizveidotas liliju šķirnes. • Tas reāli notiek tā, ka pasūtītājs atnes dažas sīpola (kas varbūt tam ir tikai vienā eksemplārā) ārējās zvīņas. • Laboratorijā tās tiek nomazgātas, mērcētas fungicīda šķīdumā, tad apkaisītas ar aktīvās ogles pulveri un ievietotas caurumotā plastikāta kastītē, pildītā ar svaigām sfagnu sūnām. • Kad pēc dažām nedēļām uz liliju zvīņām ir attīstījušies jauni mazi sīpoliņi, tos atdala un izmanto kā eksplantus.

22. Liliju mātesaugu sagatavošana • Sīpolu zvīņa, apkaisīta ar aktīvās ogles pulveri • Svaigas sfagnu sūnas

23. Inkubācija siltumā - jauno sīpoliņu veidošanai

24. Jāņem vērā, ka ievadīšana audu kultūrās vienmēr ir radošs process, un katrs gadījums ir jāizsver individuāli!

25. 5.1.4. Mērķiem atbilstoša eksplanta izvēle Auga taksona ievadīšanai in vitro, atkarībā no nepieciešamības, var izvēlēties dažādus izejmateriālus. • Var grieztspraudeņusno krūma kā to dara, piemēram, zilenēm un rozēm. • Var atpreparēt galotnes pumpurukā gerberām un ābelēm. • Var izgriezt sānpumpurusar kārtīgu apkārtējo audu slāni kā bromēlijām, u.c.

26. Liliju jauno sīpoliņu izmantošana eksplantiem

27. Rožu ievadīšana audu kultūrās • Spraudenis ar aktīvu pumpuru • In vitro plaukstoši pumpuri • Atdalīts un transplantēts dzinums

28. Ja mūsu mērķis nav panākt primārā kallusa izveidošanos, tad noderīgs varētu būt jebkurš eksplants, kas satur meristēmas šūnas, no kā mēs varam iegūt organoģenēzes iniciāciju. • Protams, ņemot jaunu kultūru, ir nepieciešams pārbaudīt dažādu eksplantu veidu priekšrocības.

29. Ievadīšana in vitro ar augu sēklām Retie augi • Retās un izzūdošās augu sugas ievadāmas pamatā ar sēklām, tās sterilizējot un izsējot mēģenēs • Cypripedium calceolus pāksts ar sēklām

30. Ja mēs gribam iegūt primāro kallusu, tad varam izolēt un salīdzināt dažādu veģetatīvo (lapas vai to gabaliņi, stumbra daļas, sakņu gabaliņi) un ģeneratīvo orgānu daļu • (pusplaukuši vai arī jaunāki pumpuri normāla kallusa-, bet ziedgultne, putekšņmaciņi ar nenobriedušiem putekšņiem, ovārijs – haploīdu kallusa šūnu iegūšanai) eksplantus. Bet vispirms ir jāpanāk šūnu dediferencēšanās.

31. Lillija • Organoģenēzes iniciācija caur primāro kallusu

32. Diferencētu šūnu genoms ir daļēji bloķēts, dažādos audos notiek atšķirīgi bioķīmiskie procesi. • Tomēr vismaz daļa augu šūnu, kas sasniegušas savu briedumu (diferencētas šūnas) spēj atgriezties sākotnējā attīstības stadijā , • genoms var tikt daļēji vai pilnīgi debloķēts. • Sekojoši notiek dediferenciācija, kā rezultātā veidojas pilnīgi vai daļēji nediferencētu šūnu masa – kalluss.

33. 5.1.5. Eksplanta sterilizācija, sterilizējošā aģenta un sterilizācijas laika izvēle • Auga daļas var sākotnēji notīrīt ar vati, samērcētu ~ 70 etanolā. Ja materiāls ir ļoti netīrs un audi nav maigi, var tīrīt pat ar mīkstu suku un ziepjūdeni, pēc tam noskalot. • Tiek praktizēta arī iemērkšana ~ 0,1% KMnO4 ūdens šķīdumā uz 5-30 minūtēm. Pēc tam skalo destilētā ūdenī un nes lamināra telpā.

34. Laminārā ir jau sagatavotas • noautoklāvētas vārglāzes – 3-6 ar sterilu destilētu ūdeni, • 1 vai 2 – sterilizējošam (-iem) ķīmiskam aģentam (-iem). Ja lieto 1 sterilizējošo šķīdumu, tad skalojamo ūdeni vajag mazāk un pietiek ar trim vārglāzēm.

35. Sterilizējošās vielas • Dzīvsudrabu saturošie savienojumi. Tie ir visefektīgākie, bet to ražošana tagad ir pārtraukta. Sulema – HgCl2, famosepts un diocīds tika lietoti 0,1%-0,2% koncentrācijā. Šķīdumi netika gatavoti tikai vienai reizei, tos varēja lietot ilgstoši, pat veselu gadu, ja tie nebija kļuvuši pārāk netīri.

36. Aktīvā hlora savienojumi. Tie ir nātrija(NaOCl)un kalcija(Ca(OCl)2)hipohlorīti, kas sevišķi populāri ir ārzemju zinātniekiem, hlorkaļķi,hloramīns B, komerciālie balinātāji. Hlora savienojumi izdala hlora smaku, kas ir ļoti nepatīkama, jo darbs nenorit velkmē, kā arī to aktivitāte nav ilgstoša; salīdzinoši vislabāk saglabājas komerciālie balinātāji (piemēram, ACE).

37. Nātrija hipohlorīts. • To parasti lieto0,5-5% koncentrācijā 1-20 minūtes. Var izmantot arī komercpreparātu “hlorokss” kas satur 5,25%-īgu NaOCl un K permanganātu ļoti niecīgā daudzumā. Pēdējais kalpo kā indikators: kad NaOCl sadalās un ir atbrīvojies hlors, šķīdums zaudē baktericīdās īpašības, bet arī K permanganāts ir atkrāsojies.

38. Na hipohlorīts ir šūnu kodolu inde,un tādēļ tas rūpīgi jāatskalo no eksplanta. Tomēr šīs vielas pēdas var palikt un tādēļ daži autori iesaka augu audus vispirms skalot 0,01 N HCl un tikai tad skalot ar destilētu ūdeni. • Skujkokiem vienu gadu vecie dzinumi sterilizēti 5,25%NaOCl šķīdumā30-60 sekundes (Harvey, Grasham, 1969).

39. Miflin (1969) ir sterilizējis sausas kviešu sēklas 3-5% NaOCl veselu stundu.Maigu audu sterilizēšanai tika izmantots 0,5% šķīdums, un sterilizācija ilga tikai 5 minūtes (Клейн, Клейн 1974).

40. Kalcija hipohlorīts • Tas irmazāk toksisksnekā Na hipohlorīts, un to lieto sakņu, bumbuļu, gumu, dzinumu, lapu, ziedu un to daļu, augļu, sēklu, lapu sterilizācijai. Hlorkaļķi sastāv gandrīz tikai noCa(OCl)2, bet satur nelielus daudzumus arī citu Ca sāļu.

41. R.G.Butenko (1964) publicējusi šādu sterilizāciju: Ca(OCl)2 šķīdums tika gatavots koncentrācijā 90 g.L-1. Ar to sterilizēti • sakņu bumbuļi 20-25 minūtes, • kokaugu dzinumi 15-30 minūtes, bet • lakstaugu jaunie dzinumi – 10-15 minūtes.

42. Lai nosterilizētu sēklas ar cietiem sēklapvalkiem, sēklas vispirms iemērca destilētā ūdenī uz 3-5 stundām, tad sterilizēja Ca hipohlorītā, atšķaidījumā 35 g.L-1 (Gautheret, 1959).

43. Hloramīns Tā iedarbība ir maigāka nekā kalcija un nātrija hipohlorītiem. Petru un Sestak (1961) lietoja 10 g hloramīna, kas satur 25% aktīvā Cl-, 90 ml-os ūdens šķīduma, sterilizējot kukurūzas graudus. Ābeļu ziedu putekšnīcas šādā pat šķīdumā tika sterilizētas 1 minūti (Petru et al., 1964).

44. Lai lietotu hloru saturošossavienojumus, tos 8-10 minūtes krata ūdens šķīdumā to labākai izšķīdināšanai, tad tos filtrē. Lieto tikai dzidrus preparātus bez nogulsnēm. Tie domātitikai vienreizējai lietošanai, un tos lieto tūlīt pēc pagatavošanas.

45. Ūdeņraža pārskābe • Arī tas ir baktericīds preparāts. H2O2 pārsvarā lieto tikai sēklu sterilizēšanai. • Lielākoties izmanto 2-10% šķīdumu, bet lieto arī neatšķaidītu, t.i., ~ 27-31%. • Harvey un Grasham (1969) sterilizējuši Larix occidentalis, Pinus nigra un Pinus ponderosa gadu vecus dzinumus ar 3% H2O2 24 stundas

46. Lietoja arī koncentrētu ūdeņraža pārskābi vairāku augu sēklu sterilizēšanai – • bērzu –45 minūtes, egļu –65 minūtes, periodiski kratot (Момот и др., 1975). • Jāpiebilst, ka sterilizāciju ar ūdeņraža pārskābi nedrīkst kombinēt ar sterilizāciju K permanganātā, jo pat nelielas vienas vielas paliekas ļoti aktīvi reaģē ar otru.

47. Izmanto arī etanolu, sudraba nitrātu, augu aizsardzībā pielietojamos fungicīdus. Katrā gadījumā, ja literatūrā nav aprakstīta sterilizācija konkrētam eksperimenta objektam, ir jāveic speciāls izmēģinājums, lai noskaidrotu atbilstošāko sterilizējošo aģentu un optimālo apstrādes laiku.

48. Pēc sterilizēšanas var būt nepieciešama arī speciāla apstrāde. Tā, piemēram, pēc sterilizēšanas ar 0,2% sulemu, kam pievienoti daži pilieni virsmas aktīvās vielas Tween 20, vispirms korķozola eksplantus 10 minūtes skaloja CaCl2 šķīdumā, 2,44 g.L-1 koncentrācijā, tad 10 minūtes askorbīnskābē, 1 g.L-1 (Manzanera, Pardos, 1990).

49. Darbojoties ar tādiem objektiem, kas griezuma vietā izdala fenolus, kā rezultātā audi brūnē un dažkārt arī eksplants var iet bojā, lieto speciālus paņēmienus. • Vieitez un Vieitez (1980) Castanea sativa eksplantiem lietojuši 2-3 stundu peldi sterilā destilētā ūdenī pirms ieviešanas in vitro kultūrā.

50. Broome un Zimmerman (1978) limitējuši audu brūnēšanu un barotnes krāsošanos, • pārstādot melleņu eksplantus svaigā barotnē jau pēc 1-2 dienām. • Citi autori barotņu krāsošanos novērš ar adsorbentu – aktīvās ogles vai polivinilpirrolidona-40 (PVP-40) pievienošanu iniciālai barotnei.