分枝杆菌分离培养、药敏试验 及菌种鉴定方法标准化

1. 分枝杆菌分离培养、药敏试验 及菌种鉴定方法标准化 河南CDC结核病预防控制所 赵玉玲 2006年4月

2. 耐药菌株尤其是耐多药菌株的不断扩散，正日益成为我国结核病控制的一大难题，若耐药结核菌的播散和流行得不到有效遏止，将会出现较多慢性传染源，从而导致结核病治疗、管理的难度进一步加大，对国家结核病防治规划的有效实施将构成威胁。因此，监测结核病耐药性情况可以为制定、评价和完善国家结核病防治规划（NTP）提供参考依据。

3. 我国2000年全国流调结核菌耐药状况 • 初始耐药：18.6% • 获得性耐药：46.5% • 总耐药：27.8%

4. 我国2000年全国流调结核菌耐药状况 • 初始耐多药率：7.6% • 获得性耐多药率：17.1% • 总耐多药率：10.7%

5. 6种抗结核药物的耐药率顺序 • 异烟肼（17.6%） • 链霉素（17.3%） • 利福平（16.6%） • 对氨基水杨酸（2.8%） • 乙胺丁醇（1.5%） • 氨硫尿（1.3%)

6. 8省（次）耐药监测耐药状况

7. 8省（次）耐药监测耐药状况

8. 8省（次）耐药监测耐药状况

9. 分枝杆菌种类 • 分枝杆菌(Mycobaterium)迄今报道有100多个种。《伯杰系统细菌学手册》将分枝杆菌军菌种划分为两大类：缓慢生长分枝杆菌与快速生长分枝杆菌。在营养丰富的培养基上，接种很稀的新鲜培养物，在适宜的培养温度下，7天以上肉眼可见单个菌落，称为缓慢生长分枝杆菌，其代表菌种是结核分枝杆菌(M.tuberculosis).在上述条件下，7天以内肉眼可见单个菌落，成为快速生长分枝杆菌。

10. 分枝杆菌种类 • 分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结核分枝杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM） • 结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌，此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外，少数人类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较弱，是热带非洲人结核病病原体。田鼠分枝杆菌对人类无致病性。

11. 分枝杆菌种类 类别Rubyun分群对人致病的分枝杆菌 缓结核分枝杆菌复合群人型、牛型、非洲型 慢非结核分枝杆菌Ⅰ群 堪萨斯、海、猿 生非结核分枝杆菌Ⅱ群 瘰疠 长非结核分枝杆菌Ⅲ群 鸟-胞内、蟾 快速生长 非结核分枝杆菌Ⅳ群 偶发、龟

12. 营养与发育 • 结核菌是兼性需氧菌，在有氧和含有比较低氧的环境下均能生存，比如骨结核，淋巴结核。 • 在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。 • 结核菌生长的适宜温度和人体相近为37℃。 • 结核菌生长所必须的元素有氧、碳、氮、氢、磷、钾、镁等。

13. 结核分枝杆菌的生长特性 • 生长适宜温度37℃，PH6.8~7.2，对营养要求较高专嗜甘油作为碳源，天门冬酰胺是最好氮源。在常用的罗氏培养基上生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透明。 • 结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10~18小时，根据接种量的多少，一般10~30天肉眼可见菌落生长。

14. 耐药性是结核杆菌的重要生物学特性 • 耐药菌不断生长繁殖，终致菌群中以耐药菌为主（敏感菌被药物淘汰），抗结核药物即失效。 • 由基因突变而出现的极少量天然耐药菌（自然变异），通常不致引起严重后果。 • 药物与结核杆菌接触后，有的细菌发生诱导变异，逐渐能适应在含药环境中继续生存（继发耐药）。 • 耐异烟肼菌株的致病力显著减弱，耐链霉素菌株的致病力一般不降低，耐利福平菌株有不同程度降低，对利福平及异烟肼同时耐药，其致病力降低较单一耐异烟肼者更显著。

15. 实验室检验技术 • 涂片染色镜检 • 分枝杆菌分离培养 • 分枝杆菌药物敏感试验 • 分枝杆菌菌种鉴定 • 血清学检测 • 分子生物学

16. 结核病细菌学实验室布局原则 • 结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得与其他实验室混用。 • 培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独立分开的场所，最好分别在专用的房间进行。

17. 分枝杆菌分离培养检查法的重要意义 • (1)不论从结核病控制、流行病学检查或临床诊断的角度看，分枝杆菌的分离培养检查法都是结核病确诊最可靠的方法，是结核病病原学诊断的“金标准”。

18. 分枝杆菌分离培养检查法的重要意义 • (2)开展进一步检测的基础 ，是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。 • (3)随着结核病控制工作水平的提高，一些具备条件的基层结核病细菌学实验室也应逐步开展分枝杆菌的分离培养.

19. 酸性改良罗氏培养基 • 成分和制备方法略。

20. 去污染处理(痰标本) • 视标本性状，加1~2倍体积4%氢氧化钠（NaOH)消化液于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋震荡器上震荡1min，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15~20min。标本较多时，应分批处理

21. 去污染处理(其他标本) • 病理组织或干酪块 标本切碎后置于无菌组织研磨器，加入适量（0.5~1ml）生理盐水后充分研磨成混悬液；混悬液经3000r/min离心30min后，沉淀物进行碱处理[与2~4倍量2%氢氧化钠（NaOH)混合，处理15min]后接种。 • 尿液 留全量夜尿，静置4~5h,取沉淀部分约10ml,3000r/min离心30 min,取沉淀进行碱处理[与等倍量4%硫酸（H2SO4）混合,处理15min]后接种.

22. 去污染处理(其他标本) • 脓液 采用4%硫酸（H2SO4）以1︰3混匀后，静置25min（期间震荡数次)，按无菌手续接种0.1ml经处理的标本至L-J培养基，每份标本接种2支培养基。酸处理去污染时间不超过25min。 • 胸腹水,支气管灌洗液标本 参照痰标本处理办法.

23. 去污染处理(其他标本) • 脑脊液 无菌操作收集的脑脊液,置冰箱或室温24h,待薄膜形成后将薄膜接种到L-J培养基;或将脑脊液 在无菌操作环境中3000r/min离心30 min,取沉淀直接接种到L-J培养基.非无菌操作采集的脑脊液标本,离心后的沉淀进行碱处理[与等倍量4%氢氧化钠（NaOH)混合,处理10~15min]后接种于酸性L-J培养基

24. 去污染处理（其他标本） • 粪便 标本与生理盐水混合后,充分振荡使之成为混悬液;定性滤纸过滤后,滤液经3000r/min离心10 min;沉淀进行酸处理[与2~4倍量的4%硫酸（H2SO4）]混合,处理15~20 min)后接种L-J培养基. • 咽喉棉拭子 将棉拭子放入一无菌试管,加入适量生理盐水浸泡,加入等体积 4%氢氧化钠（NaOH)后强烈振荡,静置15 min后接种.

25. 分离培养的操作流程 分别接种0.1ml 前处理液至2支 培养基斜面 痰标本中、加 1~2倍体积 4%NaOH 涡旋振荡 1~2min 室温静置 15min 有菌落生长需经 抗酸染色确认, 至第8周无菌落 生长报告阴性 接种后3天,7天 观察,此后每周 观察一次 置37 ℃温箱 培养

26. 简易培养程序 简易培养程序

27. 离心培养程序 离心培养程序

28. 离心力对痰涂片和培养结果的影响

29. 结果报告 • 1.接种后第3、7天各观察1次菌落生长情况。发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长分枝杆菌阳性。此后每周观察1次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告分枝杆菌生长。满8周后未见菌落生长者方可报告培养阴性结果。

30. 结果报告 • 2.观察时发现非结核分枝杆菌生长时，应报告污染。培养污染率应控制在2%~5%范围。污染率过高，提示培养基灭菌不佳，标本前处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。

31. 结果报告 • 培养结果报告方式 • (1)分枝杆菌培养阴性:斜面无菌落生长,以“培养阴性”报告,不可以“–”表示. • (2)分枝杆菌培养阳性（１＋）：菌落生长占斜面面积的1/4． • (3)分枝杆菌培养阳性（2＋）：菌落生长占斜面面积的1/2． • (4)分枝杆菌培养阳性（3＋）：菌落生长占斜面面积的3/4． • (5)分枝杆菌培养阳性（4＋）：菌落生长布满整个斜面 • (6)报实际菌落数:菌落生长不足斜面面积1/4．

32. 分离培养的注意事项 • 选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行培养阳性率较高。 • 从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟. • 涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。 • 发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方可报告阳性。

33. 分离培养的优点 • 敏感性较直接涂片法高，理论上10~100条菌/毫升可检出阳性； • 特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度，色素产生初步判断非结核分枝杆菌； • 分离出具有活力的纯培养物，为进一步试验提供基础。

34. 分离培养的缺点 • 需时长，根据接种量的大小，一般2~8周才能得到肉眼可见菌落。 • 结果受标本保存运送时间，培养基成分和质量，前处理方法等影响，操作较直接涂片法复杂，需经严格培训。 • 需培养基凝固灭菌器，离心机，涡旋振荡器，恒温培养箱等设备。 • 成本是直接涂片法的7~8倍。

35. 分枝杆菌快速培养检查 • 分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养分枝杆菌仪，通过测定细菌生长代谢而间接检测分枝杆菌生长情况的方法。由于应用营养丰富的液体培养基，并且检测仪能连续检测，故提高了从标本中分离分枝杆菌的敏感性进而缩短报告结果的时间。为保证检查方法的可靠性，目前快速培养检查系统除提供相应仪器，试剂以外，均根据不同系统制定了相应的临床标本前处理、接种、检测和报告结果的规程,故在进行相应的检查时，结果的可重复性和可比性均能得到认可。

36. 分枝杆菌快速培养检查 • 在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的去污染处理，必须严格按照系统说明书中规定的方法进行。孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸杆菌后方可发出阳性报告。

37. 几种常见分枝杆菌快速培养仪 • Bectec -TB640全自动分枝杆菌培养仪在营养丰富的培养液中加入放射性14C标记的棕闾酸作为底物，分枝杆菌生长过程中分解14C棕闾酸，产生CO2，仪器通过检测CO2含量换算成生长指数。培养时间通常需要4~25天。 • 优点：简便、快速，可进行药敏试验及初步菌种鉴定。 • 缺点：价格昂贵，需进口专利液体培养基，且有放射性污染，正逐渐被非放射性的培养方法所替代。

38. 几种常见分枝杆菌快速培养仪 • Bectec-tb960全自动快速细菌培养系统是将荧光物质包埋在7H9液体培养管的底部，分枝杆菌生长过程中，O被消耗，底物产生荧光，仪器通过测定荧光强度，用生长指数来表示测定结果，培养时间通常需要7~42天。 • 特点：简便、快速，可进行药敏试验及初步菌种鉴定。连续测定荧光强度，每60分钟自动测一次，无放射性污染。

39. 几种常见分枝杆菌快速培养仪 • Bect/alert 3D全自动快速细菌培养仪，分枝杆菌生长过程中代谢产生CO2， CO2的产生使瓶底颜色感受器产生不同的颜色变化。通过比色传感器来测定， CO2产生的速率和总量与细菌生长的速率和总量一致。 • 简便、快速，可进行药敏试验及初步菌种鉴定。既能进行分枝杆菌培养，又能进行普通菌培养，每10分钟自动测一次，无放射性污染。

40. 药物敏感性测定的重要意义 • 临床治疗的重要参考 • 流行病学的重要指标

41. 分枝杆菌药敏试验 在条件具备和有一定经验的实验室方可进行此项试验。 下列情况可进行分枝杆菌药物敏感性试验： • 初始结核病人观察起始耐药菌感染 • 复发结核病人 • 痰菌阴转后复阳者 • 化疗3~6个月痰菌持续阳性者 • 痰菌减少后又持续增加者 • 细菌流行病学检查 • 非结核分枝杆菌病等

42. 药物敏感性试验常用标准方法 • 绝对浓度法是由G. Meissner (德国) 于1964年首先提出的,是我国30 多年来一直沿用的药敏试验方法。 • 比例法是由法国的G. Canetti 和J.Grossete于1963 年首先提出,是WHO 全球耐药监测项目中推荐的标准药敏试验方法。二者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差别. • 抗性比浊法是英国科学家D.A.Mitchison首先提出,由于方法比较烦琐,现已不多用.

43. 比例法和绝对浓度法的一致性 • 　比例法和绝对浓度法是测定分支杆菌药物敏感性的二种常规方法,前者是世界卫生组织(WHO) 在“全球结核病耐药监测项目”中推荐的统一方法 ,后者是我国各级实验室30 多年来普遍沿用的方法。近年来,随着我国部分省陆续加入WHO 耐药监测项目,二种方法的一致性问题以及药敏试验是否向比例法转轨已成为国内争议的热点。

44. 比例法和绝对浓度法的一致性 • 综合以往国内有关比例法和绝对浓度法的试验报道，对2种方法研究结果显示,比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96 %以上,对于结核分支杆菌,二种方法测试H、S、R 和E 的耐药率均无显著性差异。绝对浓度法向比例法转轨，将会使我们的药敏试验结果与国际接轨 ，与国际具有可比性，而不会影响到与我国既往资料的连续性和可比性。

45. 比例法和绝对浓度法的区别 • 从试验技术角度讲,比例法与绝对浓度法的主要区别是: (1) 绝对浓度法对接种量（ 10-3mg）要求十分严格,既要避免由于过量接种产生自然突变的可能,又要保证对照培养基上菌落生长旺盛,相比之下,比例法由于设定了高、低2 个（10-4mg和10-6mg）接种量的参考系统,且试验结果的判定是通过计算活性单位的比值获得,因此对接种量这一药敏试验的重要变异因素进行了一定程度的校正．

46. 比例法和绝对浓度法的区别 • (2) 比例法定义1 %为“敏感”和“耐药”的临界点,而绝对浓度法规定低浓度含药培养基上生长的菌落数多于20 个判断为耐药,按接种菌量的活菌单位计算与比例法的1 %耐药有相同的理论 　基础。在此基础上,由于绝对浓度法每种药物设定高、低2 个药物浓度,所以绝对浓度法在一定程度上反映了耐药的程度和水平。如果说比例法是定性的药敏试验,绝对浓度法则包含有“半定量试验”之意。 （3）比例法操作较为繁琐，且需定量技术。

47. 药敏试验基础培养基 • 为无淀粉改良罗氏培养基，配方与酸性罗氏培养基相比，只有磷酸二氢钾(KH2PO4)的量不同，其他成分完全相同。

48. 抗结核药物溶液的配制和稀释 • 1.药敏试验用抗结核药物应从厂家取得纯品，并确认纯度和效价，在有效期内使用。 • 2.异烟肼(INH)、利福平(RFP)、氨硫脲(TB1)、乙硫异烟胺(TH1321)、环丝氨酸(SC)的生物效价按其重量单位计算，计算用药量时只需考虑其纯度.链霉素硫酸盐（SM-SO4)、乙胺丁醇盐酸盐（EMB-Cl)、卡那霉素硫酸盐(KM-SO4)、卷曲霉素硫酸盐(CPM-SO4)、紫霉素硫酸盐(VM-SO4)、对氨基水杨酸钠盐(PAS-Na)等在考虑其纯度的同时，应按厂家标定的毫克效价计算其盐型药用量。

49. 抗结核药物溶液的配制和稀释 • 3.加入培养基中实际药量的计算可参考下列公式： 实际药量=（培养基内药物终浓度×需制备培养基体积）/（该药物纯度×该药物校价×1000） 各变量单位：实际药量：mg 效价：% 培养基内药物终浓度： µg/ml 纯度：% 需制备培养基体积： ml

50. 抗结核药物溶液的配制和稀释 • 4 绝对浓度法按所需浓度制成高浓度药液，再按相应比例稀释成低浓度药液。 • 5.比例法按药物储存液，分装至无菌试管，每管5~10ml,封口，-20 ℃保存，3个月内使用。 注意事项：除RFP、TB1、TH1321用二甲基甲酰胺溶解，再用灭菌生理盐水稀释外，其他药物可用灭菌蒸馏水溶解、稀释。