Algoritmy v diagnostike dedičných metabolických porúch

1. Algoritmy v diagnostike dedičných metabolických porúch Význam biochemickej analýzy pri diagnostike DMP Pre zachytenie dedičných metabolických chorôb sa využíva pomerne široká škála rutinných a špeciálnych biochemických metód. Iba zriedkavo sa dá diagnóza určiť vyšetrením jediného biochemického parametra. Obvykle je potrebné použiť radu na seba nadväzujúcich vyšetrení, ktoré vytvárajú diagnostický algoritmus s cieľom potvrdiť predpokladané metabolické ochorenie. Bežne akceptované algoritmy sú zostavené tak, že najskôr využívajú finančne a pracne menej náročné metódy - orientačné vyšetrenia. Tieto vyšetrenia nemusia mať vysokú špecificitu (zachytia aj osoby bez ochorenia), avšak musia sa vyznačovať vysokou senzitivitou. Na tieto metódy nadväzuje vyšetrenie metabolitov, pomocou ktorých vieme spoľahlivejšie zadefinovať metabolický status pacienta. V diagnostike sa samozrejme využívajú aj bežné rutinné laboratórne nálezy (biochemické, hematologické). Mnohé ochorenia sa dajú zistiť tým, že monitorujeme zmeny v zastúpení metabolitov - látok, ktoré patria do rovnakej skupiny (aminokyseliny, sacharidy). Pre sledovanie tohto cieľa sú výhodné tenkovrstvové chromatografie, ktoré nevyžadujú žiadnu náročnú techniku a na jednej TLC platni je možné vyšetriť vzorky viacerých pacientov. Ich nevýhodou je, že nevedia odhaliť miernejšie zmeny v kvantite látok a vyšetrenie nemusí zachytiť pacientov s miernejšími biochemickými fenotypovými prejavmi. U mnohých DMP sa dá diagnóza určiť až na základe náročných biochemických analýz využívajúcich metódy HPLC, GC príp. GC/MS a EIMS. Glykózaminoglykány (GAG) HS- heparan sulfát DS- dermatan sulfát KS- keratan sulfát CS- chondroitín-6-suftát MPS- mukopolysacharidózy ML - mukolipidózy Obr.3: Algoritmus ďalšieho vyšetrenie pri pozitívnom náleze glykozaminoglykánov. U pacientov s predchádzajúcim pozitívnym nálezom sa zahustená frakcia GAG získa z moča vyzrážaním a centrifugáciou. Vzorky sa nanesú na acetátcelulózovú membránu a delia sa pomocou ELFO. Po rozdelení a vyfarbení frakcií sa získava obraz, ktorý je charakteristický pre jednotlivé typy ochorenia tým, že sú zmnožené niektoré frakcie. Hoci výsledok vyšetrenia jednoznačne neodhaľuje enzýmový deficit, toto vyšetrenie umožňuje indikovať cielené vyšetrenia enzýmových aktivít vo vzorkách izolovaných z leukocytov. Orientačné vyšetrenia • Medzi najčastejšie skríningové metódy pre záchyt metabolických porúch patria skúšky v moči: • Benedictova skúška na dôkaz redukujúcich cukrov • Brandova skúška na dôkaz disulfidov • Föllingova skúška na dôkaz kyseliny fenylpyrohroznovej a OH-fenylpyrohroznovej • DNFH test na dôkaz prítomnosti oxokyselín • testy na dôkaz tiosulfátov, kyseliny homogentisovej a mukopolysacharidov • V niektorých krajinách sa v orientačných vyšetreniach stanovujú aj aktivity biotinidázy v sére. PBD – porucha biogenézy peroxizómov PIPA – kyselina pipekolová PHA – kyselina fytámová PRA – kyselina pristámová THCA – kyselina trihydroxycholestanová DHCA – kyselina dihydroxycholestanová ACOX1 – peroxizómová acylCoA-oxidáza DHAP-AT –dihydroxyacylfosfát-transferáza DHAPA-S – dihydroxyacylfosfát-syntáza BP – bifunkčný enzým s aktivitami enoylhydratázy(EH) a hydroxyacylCoAdehydrogenázy (HAD) Tenkovrstvová chromatografia Medzi najčastejšie TLC vyšetrenia patria: aminokyseliny v moči a sére, oligosacharidy a monosacharidy v moči a sére. Kvantitatívne vyšetrenia Obr.4: Algoritmus diferenciálnej laboratórnej diagnostiky pri peroxizómových poruchách Kvantitatívne vyšetrenia nám dávajú oproti TLC vyšetreniam omnoho presnejšie informácie o zvýšení alebo znížení hladín konkrétneho sledovaného metabolitu, podľa čoho vieme často určiť alebo vylúčiť predpokladanú poruchu. Napríklad pri diagnostike deficitu 7-dehydrocholesterol-reduktázy znížené hladiny cholesterolu spolu s klinickým nálezom jednoznačne odôvodňujú vyšetrenie 7- a 8- dehydrocholesterolu v sére. A keďže u zdravých jedincov tento metabolit v sére nie je prítomný, aj nízke hladiny (0,1 – 1 mmol/l) sú takmer jednoznačným dôkazom ochorenia Smith-Lemli-Opitz syndróm (SLOS). Na druhej strane mitochondriálne poruchy oxidácie karboxylových kyselín aj z dôvodu veľmi premenlivého biochemického nálezu vyžadujú vyšetrenie omnoho širšej škály metabolitov ako sú napr. hodnoty VMK, ketolátky, glukóza, transaminázy, voľný karnitín, acylkarnitíny, glycínové konjugáty a organické kyseliny. Až na základe takéhoto komplexného vyšetrenia a zhodnotenia nálezu sa dá určiť diagnóza. U porúch metabolizmu mukopolysacharidov pozitivita orientačnej skúšky potvrdená zvýšeným odpadom glykozaminoglykánov je dôvodom pre indikovanie ďalších vyšetrení ako je ELFO (obr.3). Hoci algoritmus na obr.4 vyzerá veľmi zložito, v praxi diagnostika až tak zložitá nie je. V prvom kroku sa vždy vyšetrujú hodnoty VLCFA. V druhom kroku je nevyhnutné rozlíšiť, či ide o generalizovanú poruchu biogenézy - PBD (netvoria sa peroxizómy) alebo izolovaný defekt jedného enzýmu. Prakticky sa to dá zistiť vyšetrením pipekolovej kyseliny, ktorá je u PBD vždy zvýšená. Zvýšené hodnoty PHA, PRA a znížené plazmalogény len potvrdia diagnózu generalizovanej poruchy. Iba zvýšenie hodnôt VLCFA spravidla svedčí pre X-ALD. DMCH – dedičné metabolické choroby PDHK - defic. pyruvátdehydrog. komplexu GA-II – glutárové acidúrie PA – kyselina propiónová MMA – kyselina metylmalónová CPS – karbamoyl-fosfát-syntáza OTC – ornitín-transkarbamoyláza ASL – arginín-sukcinát-lyáza ASS – arginín-sukcinát-syntáza Obr.5: Algoritmus pre diferenciálnu diagnostiku porúch spojených s hyperamonémiou. Obr.1: Prehľad kvantitatívnych vyšetrení. Algoritmus na obr.5 znázorňuje aká efektívna môže byť diagnostika, keď sa na základe klinického stavu a laboratórnych vyšetrení dá takmer spoľahlivo určiť defekt. Laktátové acidémie, acidúrie Pomerne častým nálezom pri DMP sú zvýšené hodnoty laktátu v krvi alebo v plazme. Zvýšenie hodnôt nad 2 mmol/l (1,3 mol/l) je dôvodom pátrať po možnej metabolickej poruche. Tento metabolit je často zvýšený sekundárne pri viacerých metabolických ochoreniach s nálezom metabolickej acidózy. Samostatnú skupinu predstavujú laktátové acidémie, ktoré sú zapríčinené poruchami v terminálnom dýchacom reťazci, Krebsovom cykle a v glukoneogenéze. Až v 50% sú laktátové acidémie sprevádzané zvýšením hodnôt kyseliny pyrohroznovej. Vyšetrenie oboch metabolitov a určenie tzv. laktát/pyruvátového pomeru (menej ako 15) môže suponovať poruchu pyruvátdehydrogenázového komplexu. Definitívne určenie diagnózy však častokrát vyžaduje náročný diagnostický procese. A B C D Obr.6: Názorné porovnanie chromatografických GC/MS záznamov vyšetrení organických kyselín v moči a aminokyselín v sére u pacienta s diagnostikovanou DMP - fenylketonúriou. Na obrázkoch porovnávame patologické nálezy, ktoré boli zistené u pacienta s nálezmi kontrolných vzoriek zdravého jedinca. A, B– záznamy sú z vyšetrenia organických kyselín moča. U záznamu B (pacient s fenylketonúriou) pozorujeme výrazné zvýšenie odpadu metabolitov fenylalanínu v porovnaní s fyziologickým nálezom u vzorky A. Zo záznamu spektier je taktiež evidentné, že u kontrolnej vzorky sa metabolity fenyllaktát a fenylpyruvát vo vzorke nenachádzajú. C, D – záznamy sú z vyšetrenia AMK séra. U záznamu D (pacient s fenylketonúriou) pozorovať niekoľko násobné zvýšenie píku zodpovedajúcemu fenylalanínu v porovnaní so vzorkou C. Po prepočte, u pacienta boli zistené hodnoty fenylalanínu 2503 mol/l a u kontrolnej vzorky 67 mol/l. Horná hranica fyziologických referenčných hodnôt je 74 mol/l. Hmotnostné spektrá oboch vzoriek sú u daných píkov identické a zodpovedajú fenylalanínu. Týmito vyšetreniami sa u pacienta ochorenie fenylketonúria (hyperfenylalanémia) jednoznačne dokázalo. Obr.2: Algoritmus pre vyšetrenie laktátových acidémií