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Sonic hedgehog (SHH) guide les axones commissuraux le long de l’axe longitudinal du cordon spinal.

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Sonic hedgehog (SHH) guide les axones commissuraux le long de l’axe longitudinal du cordon spinal. Dimitris Bourikas et toute son équipe. INTRODUCTION.

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Presentation Transcript
sonic hedgehog shh guide les axones commissuraux le long de l axe longitudinal du cordon spinal

Sonic hedgehog (SHH) guide les axones commissuraux le long de l’axe longitudinal du cordon spinal.

Dimitris Bourikas et toute sonéquipe.

introduction
INTRODUCTION
  • Durant le développement des circuits neuronaux les axones en croissance se dirigent vers des cellules cibles,en réponse a des signaux de guidage répulsifs et/ou attractifs.
  • Un des modèles de guidage axonal très étudié est celui des axones commissuraux situés dans le tube neural.
slide4

A la partie la plus antérieur (rostrale) du Tube Neural, on a les vésicules céphaliques qui se forment.

A la partie la plus postérieur (caudale) du Tube Neural, on a une segmentation des somites.

slide5
Dans TN, on a des progéniteurs pour différentes structures cellulaires.
  • Certains vont donner des neurones commissuraux.
  • Leur axones entrent en contact étroit avec la surface de la pp, traversent la ligne médiane et tournent rostralement le long de l’axe longitudinal du cordon spinal.
slide7

BUT :

Mettre en évidence des molécules intervenant dans le guidage des axones commissuraux

slide8

Stade 23

  • Model: Embryon de poulet
  • Partie lombo-sacrale
  • Stade du développement:

Stade 24

Stade 25/26

hybridation soustractive
Hybridation soustractive :

Stade 20 Stade 26

ARNm de PP

E F G

A B C D ABCD

Comparaison

E F G

Séquençage et lignage Bio Info

ADNc

SHH

r le de shh dans le guidage axonal des neurones commissuraux 1
Rôle de SHH dans le guidage axonal des neurones commissuraux (1):
  • Perte de fonction de shh par RNAi in ovo:
  • Pas de modification sur la croissance des axones.

Wt

+RNAi

r le de shh dans le guidage axonal des neurones commissuraux
Rôle de SHH dans le guidage axonal des neurones commissuraux :
  • Absence d’orientation rostrale.
  • Les axones restent au niveau des bordure de la PP et dans la plupart des cas ils tournent caudalement…
  • …mais sembleraient rétablir leur trajectoire en formant des boucles (fig d)
slide13
La perte de fonction de SHH montre un blocage dans l’orientation rostrale des axones commissuraux.
  • Ceci a été confirmé par l’utilisation d’AC bloquant la fonction de SHH.

SHH est donc nécessaire pour le l’orientation rostrale des axones commissuraux…des expériences complémentaires ont révélés une action directe de SHH.

les r cepteurs de shh
Les récepteurs de Shh :
  • Pour savoir si Ptc et Smo sont associés aux effets de Shh sur les axones commissuraux, on analyse leur patron expression au stade 23-24.
  • Patched (Ptc) et Smoothened (Smo) = co-recepteur de Shh médiant ses activités inductibles.

Stade 23

Stade 24

patron expression de ax1 smo ptc
Patron expression de Ax1,Smo,Ptc

Hybridation in situ

Axonin-1(Ax1)=molécule d’adhésion exprimée par les axones commissuraux (AC).

Pas d’expression de Smo et Ptc par AC.

Ceci suggère qu’ils ne sont pas requis pour l’action de SHH.

Autre expérience: utilisation de cyclopamine, inhibiteur de Smo ne modifie pas l’orientation rostrale

les r cepteurs de shh hip
Les récepteurs de Shh :Hip
  • Proteine transmembranaire liant directement les proteines Hedgehog (Indian, Desert, Sonic)
  • Patron expression de Hip au stade 23,24,26
slide17

Hybridation in situ

  • Stade 23: pas d’expression de Hip.
  • Stade 24 : expression de Hip.
  • Stade 26 : peu d’expression de Hip.
  • Conclusion :
  • Hip est exprimé par quelques neurones pendant un temps bref
  • Expression temporellement et transitoire
perte de fonction de hip rnai
Perte de fonction de Hip: RNAi

Lors d’une perturbation des fonctions Hip: Phénotype identique à celui observé lors du RNAi de SHH.

Hip est le récepteur médiant l’effet de Shh.

slide19
Hip et SHH permettent d’orienter les AC au niveau rostral du cordon spinal.
  • Questions :
  • Pourquoi au niveau rostral et non caudal ?
  • Quelle est la différence entre ces deux niveaux ?
gradient de shh le long de l axe longitudinal du cordon spinal
Gradient de SHH le long de l’axe longitudinal du cordon spinal :

Hybridation in situ de shh au stade 25

  • Forte expression de SHH au niveau Caudal.
  • Faible expression au niveau rostral.

Gradient d’expression de SHH tout le long le l’axe longitudinal du cordon spinal.

Ce gradient suggère un mécanisme de répulsion de SHH sur les AC

exp rience de gain de fonction de shh
Expérience de gain de fonction de SHH :

Electroporation in ovo permettant d’exprimer Shh sélectivement :

Thoracique

Niveau supérieur lumbo-sacral

Niveau caudallumbo-sacral

slide22

Les AC ne quittent pas la PP en présence de concentration élevé de SHH.

Les AC se dirigent en évitant les concentration de SHH élevé soit caudalement soit rostralement.

slide23

Ce modèle d’étude permet de confirmer l’effet répulsif de SHH quand les neurones doivent tourner rostralement c’est-à-dire au moment oú ils expriment Hip à leur surface.

confirmation de l effet r pulsif de shh par un mod le in vitro
Confirmation de l’effet répulsif de SHH par un modèle in vitro :

Marquage des NC avec une molécule fluorescente

Explant d’embryon de stade 24-25

Culture dans gel collagène

Bille-SHH

Bille-BSA

r sultat
Résultat :

Pas de prologement d’axone en direction de la bille-SHH

Présence de prolongement d’axone en direction de la bille-BSA.

Effet répulsif de shh sur les AC du cordon spinal.

conclusion et discussion
Conclusion et Discussion :

Grâce au technique de RNAi in ovo, on a identifié le rôle de shh dans le guidage axonal.

  • Au début de la formation du TN, Shh a un effet attractant et permet la croissance des AC vers la PP du cordon spinal. Ces effets sont permis par les co-récepteurs Smo et Ptc exprimés par les AC.
  • Puis Shh dirige les AC le long de l’axe longitudinal du cordon spinal en direction rostral oú on trouve des régions pauvres en Shh. Cet effet répulsif est permis par l’expression de Hip par les AC.
quelques m canismes incompris
Quelques mécanismes incompris :
  • Hip protéine membranaire de type I :
    • Pas de domaine intracellulaire.
    • La partie C(ter) est hydrophobe donc transmembranaire.
      • Prb : Comment Hip transmet le signal pour la migration des AC au niveau rostral ?
      • Réponse : Hip pourrait être un composant d’un récepteur complexe composé d’une unité liant SHH (Hip) et d’une unité transmettant le signal qui n’ pas été encore identifié.
ad