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感受态细胞 (Competent cells)

感受态细胞制备 Preparation of competent cell 2013211030 WANG HAI JVAN. 感受态细胞 (Competent cells). 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法、 CaCl 2 、 RbCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。. 转化（ transformation ）.

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感受态细胞 (Competent cells)

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Presentation Transcript

  1. 感受态细胞制备Preparation of competent cell 2013211030 WANG HAI JVAN

  2. 感受态细胞(Competent cells) 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

  3. 转化（transformation） • 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 • 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株(Rˉ,Mˉ)。

  4. 将构建好的载体转入感受态细胞进行表达(转化)，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。将构建好的载体转入感受态细胞进行表达(转化)，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

  5. 转化的方法 化学方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞。 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。

  6. 感受态细胞的制备(CaCl2法) • 目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。细菌处于 0℃CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物。 • 钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。

  7. 实验材料和试剂 实验材料：E.coli DH5α菌株：(R-，M-，Amp-) 实验试剂： • LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用 NaOH 调pH至7.0，加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。 • LB固体培养基：液体培养基中每升加15g琼脂粉，高压灭菌。 • 0.1mol/L CaCl2溶液：称取0.28g CaCl2(无水,分析纯)，溶于50mL重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。

  8. 实验仪器 台式高速冷冻离心机

  9. 恒温摇床

  10. 实验步骤 • 取-70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于LB固体培养基，做好标记，于37℃培养过夜。 • 第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有2-5ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，37℃剧烈震荡培养约2-3小时（200-300r/min）

  11. 当菌落600nm OD值达到0.3-0.5时（生长对数期），将烧瓶取出放置冰上10-15 min。在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃,4℃，4000g离心10 min。 (注：这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞,制备成感受态后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低）

  12. 弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30 min。 注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！

  13. 4℃，4000g离心10min，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体。每管50uL分装（注意悬液密度要均匀），液氮速冻，至4℃保存备用，24-48小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于-70℃的低温冰箱中。4℃，4000g离心10min，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体。每管50uL分装（注意悬液密度要均匀），液氮速冻，至4℃保存备用，24-48小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于-70℃的低温冰箱中。

  14. 实验注意事项 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

  15. 3.实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。3.实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 4.所使用的器皿必须干净，迹量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大降低细菌的转化率。 5.所有的操作均在无菌及低温条件下进行。

  16. 怎样验证感受态细胞成功与否？

  17. 谢谢

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