1 / 55

Электрофорез раствора электролитов

V. -. +. V. F=qE=ZeE. F=fv. v. L. Электрофорез раствора электролитов. (Закон Стокса для сферических частиц ,  - вязкость среды). v ~ Z / R. t < 10 -12. Относительная подвижность (r) :. подвижность в долях подвижности быстрейшей частицы. Подвижность :. u = v / E. E 0. Z. -.

morna
Download Presentation

Электрофорез раствора электролитов

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. V - + V F=qE=ZeE F=fv v L Электрофорез раствора электролитов (Закон Стокса для сферических частиц, -вязкость среды) v ~ Z / R

  2. t<10-12

  3. Относительная подвижность (r) : подвижность в долях подвижности быстрейшей частицы Подвижность : u = v / E

  4. E0 Z - + Q1<0 Q2>0 Q3<0 - - + ∆E12 ∆E23 E12 = E0 + ∆E12 E23 = E0 - ∆E23 Принцип электронейтральности раствора

  5. I I _  S +  K A • Q = 0 A: +It – VA ZA t – VK ZK t = 0 +I – Σ{ vA ZA + vK ZK}= 0 • K: -It + VA ZA t + VK ZKt = 0 -I + Σ{ vA ZA + vK ZK}= 0 • I = Σ{ vA ZA + vK ZK} = S (nA ZA + nK ZK) • n = v C = u E C I = S (uA E CA ZA + uK E CK ZK) = = E S (uA CA ZA + uK CK ZK) = E S (uA NA + uK NK)

  6. - + ЭндоЭлектроОсмос

  7. - + u < < < < - + E 0 > 1 > 2 > 3 > v0 v1 v2 vi = = =…= ИзоТахоФорез Ei = v / ui

  8. E2, vA2, v2K, C2 E1, vA1, v1K, C1 Ширина зон при изотахофорезе Вариант 1 (изменение концентрации на границе): vграницы = vA1 = uA1E1 = uA2E2 = vA2 = v E2 = E1 uA1 / uA2 v(C1-C2) = v2KC2 - v1KC1 C2(v + v2K) = C1(v + v1K) C2/C1 = (v + v1K) / (v + v2K) = (E1 uA1 + E1 uK) / (E1 uA1 + E2 uK) C2/C1 = (uA1+uK) / (uA1+ uK uA1 / uA2) (1) Вариант 2 (равенство тока в последовательной цепи): I1 = I2 (v + v1K) C1 = (v + v2K) C2 C2/C1 = (v + v1K) / (v + v2K) = ...... (1)

  9. Предельные случаи: C2/C1 = (uA1+uK) / (uA1+ uK*uA1 / uA2) • uK 0 => C2/C1 1C1 = C2 = Ci C2/C1 = (uA1/uK + 1) / (uA1/uK + uA1 / uA2) • uK => C2/C1 1/uA1/uA2 = uA2/uA1Ci uAi Альтернативное рассмотрение предельных случаев: ( r – удельное (на единицу объема ) сопротивление ) • uK 0- проводимость обусловлена анионами • 1 / rCi * uAiEi = I * ri1 / ( Ci * uAi ) • Ei * uAi=vграниц=const1 / Ci = 1 / CjCi = Cj • uK- проводимость обусловлена катионами • 1 / rCi * uKEi = I * ri1 / ( Ci * uK ) • vграниц= Ei * uAi = uAi / ( Ci * uK ) = constuAi / Ci = const CiuAi

  10. Электрофорез в свободной среде:"Король Умер?" • "Да здравствует Король!": • электрофорез органелл в свободном потоке • капиллярный электрофорез

  11. Побочные процессы на электродах (электролиз): анод: 4OH--4e-->O2+ 2H2O pH ↓ катод:4H++ 4e-->2H2pH↑ интенсивность электролиза ~ I I = E S (uANA + uKNK) ~ C Z2 / R

  12. Буферная ёмкость cтепень диссоциации: оптимум приpH = pKa (= 0.5)

  13. Буферы для электрофореза макс. буферная ёмкость приpH = pKa(= 0.5) Катионный компонент: (HOCH2 )3CNH2pKa 8.06-8.1 (25oC) ∆ pKa / 10oC -0.310 Анионные компоненты: H3PO4pKa1 = 2.1, pKa2 = 7.2, pKa3 = 12.5 (18oC) CH3COOH pKa = 4.75(20oC) H3BO3 pKa ~ 8.5 H2NCH2CH2SO3H (Taurine) pKa1 = 1.5, pKa2 = 9.06 (25oC) HOCH2CH(NH2)COOH (Serine) pKa1 = 9.21, pKa2 = 2.20 (25oC)

  14. Проводимость растворов буферов

  15. Гели для электрофореза: Агароза Источник – мембраны клеток водорослей Агар = Агароза + Агаропектин до 6% -SO3- в основном в Агаропектине R = -H, -SO3- AP=AgarosePolymer LMT agarose

  16. Акриламид N,N'-Метиленбисакриламид O C H C H C N H O O 2 2 Гидрофобизация и Ковалентное присоединение ПААГ к стеклу C H O C H C H C C H C H C H O C 2 2 Этилендиакрилат 2 2 O O O H O H O O Cl2Si(CH3)2 C H N H C H N H C H C H C H C C C H C H C H C H C H N H C H C H N H C H C C 2 2 2 2 2 2 2 N,N'-диаллилтартардиамид (ДАТД) Преполимеризо-ванные блоки мономеров - - - . S O S O O 2 S O O O 3 3 3 LongRanger (AT Biochem) RapidGel-XL (Amersham) Персульфат (аммония)рибофлавин + свет ( C H ) N C H C H N ( C H ) 3 2 2 2 3 2 Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) Гели для электрофореза: ПолиАкрилАмид

  17. Зависимость среднего РАЗМЕРА ПОР ПААГ от концентрации мономеров и доли сшивающего агента Линейный ПАА комбинированные и "виртуальные" (с нековалентными сшивками) гели. По другим данным ср. радиус пор 7.5% ПААГ оценивается в 50Å = 5 нм, 30% - в 20Å = 2 нм

  18. Зависимость подвижности от M и размера пор геля u ~ -k log(M) Уравнение Фергюсона(1964): log(u) = log(u0) – KrCгеля • дцДНК: • 0.3-0.5% агароза от 5 до 100 kB • 1% агароза от 0.2 до 5 kB • 2% агароза от 0.1 до 2kB • 4% ПААГ от 50 до 1000 • 8% ПААГ от 20 до 600 • 20% ПААГ от 5 до 100

  19. Зависимость подвижности дцДНК от M и конформации u = {h2} Q /(L2 f) Use of Gel Retardation To Analyze Protein-Nucleic Acid InteractionsD.LANE, P.PRENTKI, and M.CHANDLER1. MICROBIOLOGIcAL REVIEWS, Dec. 1992, p. 509-528

  20. Неоднородныегели по ТОЛЩИНЕ (edge-shaped): по КОНЦЕНТРАЦИИ БУФЕРА по КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕЛЯ

  21. PusleFieldGelElectrophoresis + + время время - - + гель E -

  22. Аппараты для электрофореза

  23. Аппараты для электрофореза

  24. Способы нанесения образцов Трациционный: Shark-Teeth:

  25. Элюция биополимеров из геля • Пассивная элюция (диффузия): • с разрушением геля • без разрушения геля • Растворение геля: • спец. сшивающие агенты для ПААГ • LMT agarose (экстракция фенолом, гидролиз агаразой) • растворение агарозы в хаотропных агентах (NaI, NaClO4, соли гуанидина) Электроэлюция (на примере ячейки ISCO) - + гель диализная мембрана

  26. Перенос на мембрану (нитроцеллюлозу или капрон): - + вакуум Вакуум blot - Blot по Саузерну + Электроперенос

  27. гель 5M NaCl НЕПРЕРЫВНАЯ Элюция биополимеров из геля

  28. гель анодная камера

  29. http://caliperls.com/products/labchip-systems/labchip-xt.htm LabChip XT/XTe

  30. http://www.sagescience.com/products/bluepippin/ BluePippin

  31. Белки: • Большое разнообразие мономеров, нет универсальных свойств. • заряд [ –N ; +N ] • заряд сильно зависит от pH ( Z(pI) = 0 ) • денатурация: • 2-меркаптоэтанол, нагревание : разрушение -S-S- связей • SDS (ДСН, CH3(CH2)11SO3Na) : нормализация формы (упругий стержень) и заряда (Z ~= -kN)

  32. - Gly- Gly- Cl- Gly- Cl- Cl- Cl- Gly- Cl- + DISCэлектрофорез на примере электрофореза белков в присутствии SDSпо U. Laemmli (модифицированная система буферов Орнштейна и Девиса) Катодный буфер: Gly-/GlyH 0.005М Tris:Glycine pH8.3 Gly -/GlyH Концентрирующий гель: pH 6.8 pH 6.8 0.05-0.07М Tris:Cl pH6.8 <0.002 <0.002 3-4% ПААГ Разделяющий гель 0.35-0.4М Tris:Cl pH8.9 pH 8.9 pH 8.9 >0.15 >0.15 Анодный буфер: Изотахофорез: Электрофорез в 0.1М Tris:Cl pH8.0 - - лидирующий однородном буфере Cl - - - замыкающий на фоне Gly Gly Glycine: NH -CH -COOH , 2 2 pKa =2.34, pKa =9.6, pI=5.97 2 1

  33. Изоэлектрофокусирование (IEF) Амфолины (свободные и иммобилизованные)

  34. IEF after 45 min Start of IEF Different abnormal Hemoglobins run bidirectional

  35. Different abnormal Hemoglobins, Coomassie-stained Different abnormal Hemoglobins, Bromophenol-stained

  36. Silver stained IEF

  37. Нуклеиновые кислоты: • постоянное отношение заряд / размер: Z ~= -N (-2N) • малая зависимость заряда от pH • в физиологическом диапазоне pH • ([Cp] pKa1=4.5; [Gp] pKa1=2.4, pKa2=9.4;[Up] pKa1=9.5; [dTp] pKa1=10.0; • [Ap] pKa1=3.8, [dAp] pKa1=4.4) • денатурация: • применительно к НК – переход в • одноцепочечную форму) • нагревание выше 65-70 oC • хаотропные агенты: (NH2)2CO , HCONH2 • pH > 9.5-10

  38. Электрофорез в неденатурирующих условиях Подвижность оц- и дц- нуклеиновых кислот,зависимость от конформации (кольцо, супервитки), присутствия EtBr подвижность линейных и кольцевых дцДНК электрофорез с разделением цепей дцДНК

  39. Электрофорез в денатурирующих условиях DISC (SO4-)

  40. DGGE:выявление гетеродуплексов гетеродуплекс гомодуплекс плавлениегетеродуплекса плавление гомодуплекса Варианты: TGGE, градиентнаяионообменная HPLC

  41. Афинный электрофорез на примере электрофореза tRNA, имеющих сульфосодержащие основания Гель содержит [(N-акрилоамино)фенил]ртуть : Interaction of tRNAs and of Phosphorothioate-Substituted Nucleic Acids with an Organomercurial. Probing the Chemical Environment of Thiolated Residues by Affinity Electrophoresis. Gabor L. Igloi. Biochemistry 1988, 27, 842-3849

  42. + - Электрофорез на целлюлозе с неподвижными границами (изотахофорез в равновесии с эндоэлектроосмосом)(Абелев Г.И. и др.) • Преимущества: • концентрирование проб, независимость результата от объема нанесения • независимость результата от времени ведения процесса • возможность легкой адаптации к самым разным задачам (разделяемым смесям)

  43. CИСТЕМА КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА «КАПЕЛЬ» • кварцевые с внешним полиимидным защитным покрытием капилляры (внутр. диаметр 50-75 мкм, внешний 365 мкм, общая длина 30-100 см); • положительные и отрицательные напряжения до 30 кВ; • для ввода пробы применяют избыточное давление (гидродинамический способ) или высокое напряжение (электрокинетический). Объем пробы составляет несколько нанолитров; • для регистрации электрофореграмм используют УФ-детектирование непосредственно в капилляре, в прямом и косвенном вариантах Si=0 -> Si(OH)2 Ka1 ~ 4 x 103 При C однозарядного электролита 1 – 0.1 mМтолщина двойного электрического слоя составляет в среднем 30 – 50 мкм. При диаметре канала 50 – 100 мкм практически вся жидкость, заполняющая капилляр, представляет собой диффузную часть двойного электрического слоя. Электроосмотический поток направлен к катоду. Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ): использование встречного потока мицелл детергента (ДСН) для разделения нейтральных молекул форм веществ (аналог ВЭЖХ) .

  44. Microchip Electrophoresis System Shimadzu MCE-202 MultiNA

  45. http://www.genomics.agilent.com Agilent 2100 bioanalyzer Whole Cells DNA Protein

  46. "ГЕННЫЙ АНАЛИЗАТОР" ABI 310 (Applera = Applied Biosystems+Сelera Genomics)

More Related