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细胞实验（二） 细胞损伤与保护 2

细胞实验（二） 细胞损伤与保护 2. 设 3 组不同的细胞组 正常、损伤、损伤恢复 用不同的实验方法检测、验证实验结果. 实验内容. 细胞电子显微镜检测 细胞活率测定 亚细胞结构的分离与鉴定. 实验设计. 1. （ 电镜） 每班传细胞入含小盖片培养瓶 6 瓶（ 2 组） 2 瓶正常、 4 瓶损伤、第二天 2 瓶损伤后恢复 2. （ 活率 ）每组传细胞入 96 孔培养板 9 孔 3 孔正常、 6 孔损伤、第二天 3 孔损伤后恢复 3. （ 分离 ）每班传代细胞 8 瓶 4 瓶细胞 1 传 2 至 25ml 培养瓶成 8 瓶细胞. 细胞电子显微镜检测.

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细胞实验（二） 细胞损伤与保护 2

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Presentation Transcript

  1. 细胞实验（二）细胞损伤与保护2 • 设3组不同的细胞组 正常、损伤、损伤恢复 • 用不同的实验方法检测、验证实验结果

  2. 实验内容 • 细胞电子显微镜检测 • 细胞活率测定 • 亚细胞结构的分离与鉴定

  3. 实验设计 1. （电镜）每班传细胞入含小盖片培养瓶6瓶（ 2组） 2瓶正常、4瓶损伤、第二天2瓶损伤后恢复 2. （活率）每组传细胞入96孔培养板9孔 3孔正常、6孔损伤、第二天3孔损伤后恢复 3. （分离）每班传代细胞8瓶 4瓶细胞1传2至25ml培养瓶成8瓶细胞

  4. 细胞电子显微镜检测 细胞电镜标本制备

  5. 原 理 光学显微镜无法看清小于0.2um的细微结构，我们把这些细微结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。

  6. 电子显微镜与光学显微镜 的结构，从原理上来说是相似 的，但也有不同之处。

  7. 首先不同的是用电子束（电子流）代替照明光源。首先不同的是用电子束（电子流）代替照明光源。 • 其次，电镜使用的是电子透镜，而不是光学透镜，电子透镜不是肉眼可见的物质透镜，它是由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间来起到透镜的作用。 • 第三个区别是成像原理不同。其成像是由于标本中不同结构中原子与电子发生碰撞后，造成电子散射角度不同，使荧光屏上的电子强度也相应不同。

  8. 电镜制样技术 由于电子束的穿透能力有限，为了获得较高分辨率，需要使用超薄切片机制成厚度一般仅为40～50nm的超薄切片。这就需要样品有一定的刚性和韧性，为此，样品需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构，因此超薄切片样品制备的第一步就是固定，其后依次是包埋、切片和染色。

  9. 超薄切片的制备 1、固定：戊二醛和（OsO4）等， 锇酸后固定。 2、包埋：环氧树脂和丙烯酸树脂等。 3、切片：玻璃刀用超薄切片机切片， 厚度40～50nm，切片收集在 铜网或镍网上，在电镜下观察。 4、染色：常用的染色液是醋酸双氧铀（易 染核 酸）和铅盐（易染蛋白质）。

  10. 结 果 • 在电子显微镜下观察 比对正常、损伤及损伤后恢复标本 • 照相 • 分析 • 总结

  11. 要 求 • 送标本 • 照片结果分析

  12. 细胞活率测定 MTT比色法

  13. 原　理 • 四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝MTT)是一种能接受Ｈ原子的染料。可透过细胞膜进入细胞内。活细胞线立体中琥珀酸脱氢酶，能使外源性淡黄色的 (MTT)还原成难溶于水的结晶，并沉淀在细胞中。其形成量与活性呈正相关。该结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪，在波长492nm测定其光吸收值。可间接反映活细胞的数量变化。

  14. 器材与试剂 • 器材：培养细胞(96孔细胞培养板) 　　　　酶标仪、移液抢、抢头等 • 试剂：5mg/ml MTT溶液 　　　　二甲亚砜（DMSO）溶液 DMEM培养液（高糖、无糖）

  15. 实验步骤 1、接种1.5×104/ml细胞于96孔板：每组9孔 2、每孔加200ul培养液：3孔正常（高糖）、 3孔损伤（无糖）、3孔损伤恢复（无糖 有糖 ），37oC、5%CO2、饱和湿度下培养； 3、测定前2h，每孔吸弃原培养液，加高糖培养 液180ul 、再加 MTT溶液20ul，继续培养； 4、到2h测定时，每孔吸弃培养液， 加DMSO 溶液150ul，振荡5分钟； 5、酶标仪492nm波长处比色。 5h

  16. 结　果 • 记录酶标仪上光吸收值 • 分析每组细胞生长情况

  17. 注意事项 • 每孔的细胞密度不能超出1x105 /ml， 避免影响实验的区分度； • 高浓度血清会导致实验本底增高， 比色前尽量使血清浓度不超过10%。

  18. 亚细胞结构的分离与鉴定 细胞核的提取

  19. 原 理 细胞内各种细胞器质量不同，在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理，常用差速离心法、密度梯度离心法来分离各种细胞器。 分离的各种细胞器可以用组化等方法加以鉴定。

  20. 本实验利用此原理仅对细胞核进行分离、鉴定，其上清液可作进一步分离。本实验利用此原理仅对细胞核进行分离、鉴定，其上清液可作进一步分离。

  21. 器材与试剂 • 细胞株CHL • 离心机、天平、离心管、显微镜、 染色缸、滴管等 • 消化液、0.075M KCl、0.25%蔗糖溶液、 甲醇固定液、Giemsa染液

  22. 操 作 收集细胞（消化法 ）——离心(1000/min×5’ ) ——沉淀加0.075M KCl 4ml，冲打，静置20min——离心(1500/min×10’ ) ——取沉淀加蔗糖溶液4ml，打匀——离心（2500/min×10’）——取沉淀加少量固定液涂片——酒精灯烤干——甲醇固定5 ’——Giemsa染色5 ’——自来水冲洗——吸水纸吸干玻片（反面）——显微镜10倍或40倍下观察（鉴定）

  23. 结 果 • 细胞核染成深兰色

  24. 注意事项 • 注意正确使用离心机（平衡、对称） • 正确使用显微镜 • 染液临用前稀释 （PBS：Gimsa原液9：1） back

  25. 告 知 实验（三） Bax蛋白在不同细胞中表达差异检测 （免疫组化法）

  26. 试验前准备 • 细胞模型制备与MTT法同

  27. 准备 • 96孔板8块、细胞6瓶 • 2个班公用1块板，使用前照射半小时。每班8组，96孔板重复使用，周边留空。每组接种细胞9孔、200ul • 4瓶传代 • 1瓶加10mlDMEM液，做MTT • 1瓶加6mlDMEM液接种小盖3瓶，

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