细胞实验(二)
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细胞实验(二) 细胞损伤与保护 2 PowerPoint PPT Presentation


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细胞实验(二) 细胞损伤与保护 2. 设 3 组不同的细胞组 正常、损伤、损伤恢复 用不同的实验方法检测、验证实验结果. 实验内容. 细胞电子显微镜检测 细胞活率测定 亚细胞结构的分离与鉴定. 实验设计. 1. ( 电镜) 每班传细胞入含小盖片培养瓶 6 瓶( 2 组) 2 瓶正常、 4 瓶损伤、第二天 2 瓶损伤后恢复 2. ( 活率 )每组传细胞入 96 孔培养板 9 孔 3 孔正常、 6 孔损伤、第二天 3 孔损伤后恢复 3. ( 分离 )每班传代细胞 8 瓶 4 瓶细胞 1 传 2 至 25ml 培养瓶成 8 瓶细胞. 细胞电子显微镜检测.

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细胞实验(二) 细胞损伤与保护 2

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Presentation Transcript


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细胞实验(二)细胞损伤与保护2

  • 设3组不同的细胞组

    正常、损伤、损伤恢复

  • 用不同的实验方法检测、验证实验结果


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实验内容

  • 细胞电子显微镜检测

  • 细胞活率测定

  • 亚细胞结构的分离与鉴定


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实验设计

1. (电镜)每班传细胞入含小盖片培养瓶6瓶( 2组)

2瓶正常、4瓶损伤、第二天2瓶损伤后恢复

2. (活率)每组传细胞入96孔培养板9孔

3孔正常、6孔损伤、第二天3孔损伤后恢复

3. (分离)每班传代细胞8瓶

4瓶细胞1传2至25ml培养瓶成8瓶细胞


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细胞电子显微镜检测

细胞电镜标本制备


2

原 理

光学显微镜无法看清小于0.2um的细微结构,我们把这些细微结构称为亚显微结构(submicroscopic structures)或超微结构(ultramicroscopic structures;ultrastructures)。要看清这些结构,就必须选择波长更短的光源,以提高显微镜的分辨率。


2

电子显微镜与光学显微镜

的结构,从原理上来说是相似

的,但也有不同之处。


2

  • 首先不同的是用电子束(电子流)代替照明光源。

  • 其次,电镜使用的是电子透镜,而不是光学透镜,电子透镜不是肉眼可见的物质透镜,它是由磁或电所形成的磁场或电场的局部空间来起到透镜的作用。

  • 第三个区别是成像原理不同。其成像是由于标本中不同结构中原子与电子发生碰撞后,造成电子散射角度不同,使荧光屏上的电子强度也相应不同。


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电镜制样技术

由于电子束的穿透能力有限,为了获得较高分辨率,需要使用超薄切片机制成厚度一般仅为40~50nm的超薄切片。这就需要样品有一定的刚性和韧性,为此,样品需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构,因此超薄切片样品制备的第一步就是固定,其后依次是包埋、切片和染色。


2

超薄切片的制备

1、固定:戊二醛和(OsO4)等, 锇酸后固定。

2、包埋:环氧树脂和丙烯酸树脂等。

3、切片:玻璃刀用超薄切片机切片,

厚度40~50nm,切片收集在

铜网或镍网上,在电镜下观察。

4、染色:常用的染色液是醋酸双氧铀(易

染核 酸)和铅盐(易染蛋白质)。


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结 果

  • 在电子显微镜下观察

    比对正常、损伤及损伤后恢复标本

  • 照相

  • 分析

  • 总结


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要 求

  • 送标本

  • 照片结果分析


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细胞活率测定

MTT比色法


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原 理

  • 四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝MTT)是一种能接受H原子的染料。可透过细胞膜进入细胞内。活细胞线立体中琥珀酸脱氢酶,能使外源性淡黄色的 (MTT)还原成难溶于水的结晶,并沉淀在细胞中。其形成量与活性呈正相关。该结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解,用酶联免疫检测仪,在波长492nm测定其光吸收值。可间接反映活细胞的数量变化。


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器材与试剂

  • 器材:培养细胞(96孔细胞培养板)

        酶标仪、移液抢、抢头等

  • 试剂:5mg/ml MTT溶液

        二甲亚砜(DMSO)溶液

    DMEM培养液(高糖、无糖)


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实验步骤

1、接种1.5×104/ml细胞于96孔板:每组9孔

2、每孔加200ul培养液:3孔正常(高糖)、

3孔损伤(无糖)、3孔损伤恢复(无糖

有糖 ),37oC、5%CO2、饱和湿度下培养;

3、测定前2h,每孔吸弃原培养液,加高糖培养

液180ul 、再加 MTT溶液20ul,继续培养;

4、到2h测定时,每孔吸弃培养液, 加DMSO

溶液150ul,振荡5分钟;

5、酶标仪492nm波长处比色。

5h


2

结 果

  • 记录酶标仪上光吸收值

  • 分析每组细胞生长情况


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注意事项

  • 每孔的细胞密度不能超出1x105 /ml,

    避免影响实验的区分度;

  • 高浓度血清会导致实验本底增高,

    比色前尽量使血清浓度不超过10%。


2

亚细胞结构的分离与鉴定

细胞核的提取


2

原 理

细胞内各种细胞器质量不同,在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理,常用差速离心法、密度梯度离心法来分离各种细胞器。

分离的各种细胞器可以用组化等方法加以鉴定。


2

  • 本实验利用此原理仅对细胞核进行分离、鉴定,其上清液可作进一步分离。


2

器材与试剂

  • 细胞株CHL

  • 离心机、天平、离心管、显微镜、

    染色缸、滴管等

  • 消化液、0.075M KCl、0.25%蔗糖溶液、

    甲醇固定液、Giemsa染液


2

操 作

收集细胞(消化法 )——离心(1000/min×5’ ) ——沉淀加0.075M KCl 4ml,冲打,静置20min——离心(1500/min×10’ ) ——取沉淀加蔗糖溶液4ml,打匀——离心(2500/min×10’)——取沉淀加少量固定液涂片——酒精灯烤干——甲醇固定5 ’——Giemsa染色5 ’——自来水冲洗——吸水纸吸干玻片(反面)——显微镜10倍或40倍下观察(鉴定)


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结 果

  • 细胞核染成深兰色


2

注意事项

  • 注意正确使用离心机(平衡、对称)

  • 正确使用显微镜

  • 染液临用前稀释

    (PBS:Gimsa原液9:1)

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告 知

实验(三)

Bax蛋白在不同细胞中表达差异检测

(免疫组化法)


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试验前准备

  • 细胞模型制备与MTT法同


2

准备

  • 96孔板8块、细胞6瓶

  • 2个班公用1块板,使用前照射半小时。每班8组,96孔板重复使用,周边留空。每组接种细胞9孔、200ul

  • 4瓶传代

  • 1瓶加10mlDMEM液,做MTT

  • 1瓶加6mlDMEM液接种小盖3瓶,


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