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UE Spécifique. ANALYSE ET METHODES D ’ ETUDE DU GENOME. I- STRUCTURE DU GENOME. Organisation Composition Les différentes séquences Le gène. INTRODUCTION. Ensemble du matériel génétique d ’ un organisme

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Presentation Transcript

  1. UE Spécifique ANALYSE ET METHODES D’ ETUDE DU GENOME

  2. I- STRUCTURE DU GENOME • Organisation • Composition • Les différentes séquences • Le gène

  3. INTRODUCTION • Ensemble du matériel génétique d’un organisme • Il est constitué d’ADN pour la majorité des organismes • Certains virus ont un génome constitué d‘ARN • La taille du génome varie en fonction des espèces

  4. ORGANISATION • Chez la majorité des bactéries ( procaryotes) le génome est contenu dans UN seul chromosome circulaire • Le génome peut être linéaire (actinomycètes) • Chez les eucaryotes : ADN nucléaire , ADN mitochondrial

  5. DENSITE DES GENOMES • Chez E.Coli , le génome est composé presque exclusivement de gènes • 4.6 Mégabases / 4000 Gènes / soit 950/MGb • Chez l’Homme • 3200 Mégabases / 25000 Gènes / 8 / MGB • La quasi-totalité génome bactérien est codant !

  6. Espèce Humaine • Génome nucléaire: 3,2 109 pb pour n chromosomes et répartis dans 22 autosomes + 2 chromosomes sexuels • Génome mitochondrial : 16 559 pb, épisome • Aucune corrélation entre la taille du génome et la complexité des organismes • Plus grands génomes : > 150 109 pb : pins, plantes

  7. COMPOSITION DU GENOME HUMAIN Des gènes : environ 25 000 composés de séquences codantes ( exons) et non codantes (les introns, séquences régulatrices; promoteur, silencer, enhancer …) régions codantes : 1.5% du génome ; introns 25%, région régulatrices: 5% Des Pseudogènes 1.5% De très nombreuses séquences répétèes 60% Autres régions non codantes : séquences uniques ou très peu répétées 7%

  8. Séquences répétées • Répétées en Tandem • minisatellites: des séquences de 10 à 25 pb sont répétées un grand nombre de fois • ( empreintes génétiques) • microsatellites : 1à 5 pb répétées x fois sur plusieurs kb • ADN satellite : centromères , télomères ( 10% du génome humain)

  9. Microsatellites Dispersés sur tout le génome 1 à 5 nucléotides Copies A(n) / T(n) 107 (CG)n / (CA)n/ (GT)n 7  106 (CT)n / (GA)n 3 x 106 Les plus étudiés (CG; CA)n CG n = 23 n = 20 n = 15 CGCGCGCG  TANDEM

  10. Séquences répétées dispersées Les SINE(s) blocs de 130 à 500 pb ( Alu) Les LINE(s) blocs de 5- 7 kb Les LTR(s) quelques dizaines de paires de bases ( 400 000 copies) Les transposons ( 300 000 copies)

  11. Séquences répétés dispersées SINEs : Famille ALU Copies : 7  105 250-400 pb 250-400 pb 104 pb ALU ALU Famille Kpn (L1) 1300 pb copies 6  104 Peuvent être transcrites

  12. Séquences SINEs ALU REPEAT 120 135 290 (AAA)n AT RICH GC RICH GC RICH (AAA)n

  13. Eléments transposables IS éléments 2600 – 700 pb 5'  3' CTGACTT 3'  5' TTCAGTC Répétition aux extrêmités (Maïs)

  14. Gène Séquence d'acides nucléiques contenant une information codée, transmissible, pour la production régulée d'un ARN (transcription), ce dernier pouvant être traduit en une chaîne polypeptique Certains gènes codent seulement des ARN sans traduction en protéine

  15. Les gènes des rétrovirus sont constitués d'ARN

  16. Pseudogènes • Séquences partiellement homologues aux gènes qui ne donnent jamais de protéines correspondantes  Soit anciens gènes fonctionnels qui ont muté  Soit des ARN  retro-transcrit  ADN  intégration ADN génomique ( transposition)

  17. ANATOMIE DU GENE b globine

  18. Zone des promoteurs 5' UTR 3' UTR 30 31 104 105 146 1 Exon I IVS2 Exon III IVS1 Exon II Gène b globine 1600 pb

  19. Région régulatrice en 5'Zone des promoteurs Facteurs de transcription -105 -100 -80 -70 -30 -25 CAP CACCC CACCC CCAAT TATA A/T A A/T A G Site d'initiation de la transcription G CCCCC

  20. Région 5' non Traduite5' UTR CAP Codon initiateur 8 - 13 +30...... CACCATG +50 0 CTTCTG Région 5' UTR - Attachement aux ribosomes - Régulation transcription +/-

  21. Exon Partie codante d'un gène  protéine ATG IVS1 Exon 1 30 Exons  Traduction  protéine

  22. IVS1 130 pb Exon 2 Zone non traduite GT Donneur de l'épissage AG Accepteur de l'épissage

  23. Région 3' UTR Codon 147 146 AATAAA STOP 20 AAAAAA 132 Nucléotides AATAAA : Signal de polyadénylation : Clivage de l'ARN après transcription (AAAAA)n : Stabilise l'ARN ( ajouté après la transcription)

  24. II ETUDE DU GENOME A- Les expériences fondamentales qui ont révélé l’ existence de l’ADN comme Génome • L’ Etude du génome complet d’un individu est très récente et découle du séquençage d’un génome entier ( début XXI)

  25. C’est l’analyse de l‘ADN • Elle était indirecte avant l’invention des techniques du séquençage (1977) • Elle utilisait l’étude des protéines qui renseignaient indirectement sur les gènes • Des mutants de bactéries , de drosophiles

  26. Origines de l’étude du Génome • Dès le XIX siècle : l’étude de la transmission des caractères sur des critères d’analyses qualitatives et statistiques ( Lois de Mendel 1860) Mise en évidence de l ’ADN (1865) Génétique formelle Morgan ( 1920 drosophile) critères d’analyses qualitatives et statistiques • Puis des techniques bactériologiques et biochimiques ont permis de franchir une étape dans le degré d’investigation de l’étude des génomes ( 1920-1952) • Structure ADN (1953 )

  27. Expérience de Griffith (1928) Bactérie : Diplococcus pneumoniae 2 souches S = capsule polysaccharidique > infectieux R = dépourvue de capsule > non infectieux

  28. Des lots de souris • Groupe1 : Injection souche S à des souris > pneumonie • Groupe 2 : Injection souche R > pas d’infection • Groupe 3: Injection d’une souche R + souche S préalablement tuée par la chaleur • => pneumonie

  29. RESULTAT Le sang des souris du groupe 3 est mis en culture : on recueille soit des souches R soit des souches S virulentes ... L’expérience fût refaite en 1944 avec la conclusion que l’ADN était le matériel héréditaire

  30. Avery, Mac Leod, Mac Carthy Interprétation : Les souches S tuées sont capables d’induire une transformation des bactéries R en bactéries S Quelle est la nature de ce matériel transmissible ? En ajoutant l’ ADN purifié des souches S à des colonies de type R les colonies R > S Les autres fractions (polysaccharides,protéines) n’ont pas de pouvoir transformant...

  31. Lorsque l’ADN des souches S est traité par la DNAse avant d’être ajouté aux bactéries de souche R > pas de bactérie de type S La transformation des souches R en souche S est la conséquence d’un transfert d’ADN L’ADN est donc le matériel génétique

  32. De 1944 à 1952 une partie de la communauté scientifique n’était toujours pas convaincue par cette conclusion et l’hypothèse que les protéines étaient le matériel héréditaire était encore défendue

  33. Colette VENDRELY ( professeur d’embryologie à Amiens ) & R. VENDRELY démontrent en 1949 que la quantité d‘ADN présente dans les gamètes est la moitié de celle contenue dans les cellules somatiques. Ce résultat est le seul travail français internationalement cité comme contribution majeure à la preuve de l’ADN comme matériel héréditaire

  34. UN pas décisif vers la découverte de la structure de l ’ADN En 1950 Erwin Chargaff découvre que l'adénine et la thymine existent en quantités égales, et qu'il en est de même de la guanine et de la cytosine, d'où la célèbre équation % A = % T % G = % C

  35. Expérience Hershey & Chase 1952, ils démontrent en utilisant le phage T2 traité au tritium * (acides nucléiques radio-actifs) que les ADNs répliqués sont radioactifs. Les protéines ne sont pas radioactives donc ne se répliquent pas …

  36. Découverte de la structure de l’ADN 1953

  37. Découverte de la structure de l’ADN

  38. “ It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material ” . « Il n’ a pas échappé à notre attention que la les appariements spécifiques que nous proposons suppose immédiatement un mécanisme de copie du matériel génétique  » Le modèle de réplication semi-conservatif sera prouvé en 1958 par Meselson et Stalh

  39. Le modèle semi conservatif de la réplication Le bon modèle pour 3 possibilités

  40. modèle conservatif A partir d'une molécule d'ADN bicaténaire "mère", on forme une nouvelle molécule d'ADN bicaténaire.On garde donc ici une molécule "mère", non modifiée (elle est donc conservée), tout en "créant" une nouvelle molécule ("fille").

  41. On ne conserve aucun brin intact.La copie se réalise par fragments dispersés dans l'ensemble de l'ADN, permettant de former les deux molécules d'ADN bicaténaires "filles".

  42. Dissociation des deux brins de la molécule d'ADN bicaténaire "mère".Chaque brin sert donc de matrice à la synthèse d'un brin complémentaire, l'ensemble reformant une molécule d'ADN bicaténaire. Chaque nouvelle molécule "fille" ne conserve donc que la moitié de la molécule mère

  43. Dans le tube 0 la totalité de l’ADN est marqué à l’ azote 15 ( les 2 brins) . Après une réplication la moitié de l’ADN est radio actif . Au fur et à mesure des réplications la quantité d’ADN marqué diminue l’ADN au profit d’abord d’ ADN hybride , puis d’ADN froid.

  44. Le résultat observé après séparation des ADNs répliqué correspond au modèle semi conservatif

  45. Propriétés physico-chimiques Déroulement de tout l’ ADN d’une cellule d’un individu : 1.6 Mètre Déroulement de l’ADN de toutes les cellules d’un individu : diamètre du système solaire! ADN cellulaire : 6,6-6,4 x 10 9 pb (2n)

  46. Quelques valeurs … • Pb = 6 .10 9 • Masse Moléculaire = 2x330 g x 6.109 /6,02.1023 moles de nucléotides • > = 6,6.10-12 g d’ADN • Il y a environ 6 picogrammes d’ADN dans une cellule diploide • 1 µg d’ADN génomique -> 10-6 g /6.6 10-12 g/cellule >> • 107 cellules diploides

  47. II ETUDE DU GENOME • B) LES OUTILS

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