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组会汇报

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组会汇报. 多杀菌素高产菌株发酵方面 研究现状 汇报人:王美玲 指导导师:卢文玉 -. 分批发酵动力学研究. 刺糖多孢菌的诱变. 发酵工艺优化. 多杀菌素的理化性质. 多杀菌素类化合物是由 刺糖多孢菌 经 有氧发酵 后的 次级代谢产物 。本质上属 大环内酯类 化合物,且没有 抑菌活性 。纯多杀菌素包含6种成分,其中组分A和D的活性最高。 刺糖多孢菌的培养温度约为 24-32℃ ,而产素的最适温度为 28-30℃ 。大规模发酵时应通过通气量和搅拌速度来维持罐内溶解氧在60%以上,最好为 65%以上 。罐内压力为0.034Mpa. 单孢子悬液. 诱变/抗性物质.

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Presentation Transcript
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组会汇报

多杀菌素高产菌株发酵方面

研究现状

汇报人:王美玲

指导导师:卢文玉

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分批发酵动力学研究

刺糖多孢菌的诱变

发酵工艺优化

多杀菌素的理化性质

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多杀菌素类化合物是由刺糖多孢菌经有氧发酵后的次级代谢产物。本质上属大环内酯类化合物,且没有抑菌活性。纯多杀菌素包含6种成分,其中组分A和D的活性最高。多杀菌素类化合物是由刺糖多孢菌经有氧发酵后的次级代谢产物。本质上属大环内酯类化合物,且没有抑菌活性。纯多杀菌素包含6种成分,其中组分A和D的活性最高。
  • 刺糖多孢菌的培养温度约为24-32℃,而产素的最适温度为28-30℃。大规模发酵时应通过通气量和搅拌速度来维持罐内溶解氧在60%以上,最好为65%以上。罐内压力为0.034Mpa
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单孢子悬液

诱变/抗性物质

复壮

单菌落筛选

培养基优化

初筛

测定稳定性、菌态、性状

高产菌株

复筛

发酵条件优化

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1、诱变突变株:
  • 菌丝诱变、萌发孢子诱变: 单一诱变和复合诱变

2、抗性突变株:

  • 多杀菌素抗性突变株:(双层培养法筛选)
  • 鼠李糖(初级代谢终产物、前体)

3、耐代谢产物结构类似物突变株:

  • 庆大霉素、红霉素、安普霉素

4、诱变和抗性结合(多重迭代)

5、耐C源分解代谢物阻遏突变

2-脱氧-D-葡萄糖

6、原生质体融合技术

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诱变剂
  • 无论化学诱变剂还是物理诱变剂,单独使用很少能收到预期的效果。所以生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法
  • UV 和氯化锂(LiCl)复合诱变,硫酸二乙酯( D E S ) 诱变,亚硝基胍(N T G) 诱变,D E S和LiCl 复合诱变,60Co g 及137Cs g 诱变 、微波诱变、MNNG
  • LiCl 本身无诱变作用
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原生质体制备条件和再生研究
  • (1)菌丝生长曲线(对数中期)
  • (2)Gly对再生的影响(干扰细胞壁的形成)
  • (3)溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶浓度、作用时间、温度的影响(渗透压、稳定剂,Nacl、蔗糖)
  • (4)原生质体的灭活(热、紫外)
  • (5)融合:
  • (种间和种内,与红色糖多孢菌?)(不同分子量和浓度PEG、电融合)
  • (6)再生培养基的选择(琼脂浓度)
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培养基的优化(发酵和种子培养基)
  • (1)单一C(N)源、复合C(N)源、有(无)机氮源、微量元素、均与设计实验、正交试验
  • (2)响应曲面法
  • 单因素试验 P-B试验 SAS软件分析 显著因素 中心组合设计 响应面回归分析 三维图 最优方案
  • (3)研究C/N比对菌丝形态和产量的影响(红霉素)
  • (4)搜集剂(磷钙、沸石)对产量和PH影响
  • (铵离子)
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发酵条件优化
  • 1、种子液的影响
  • 接种量、种龄
  • 2、摇瓶发酵条件的优化
  • 发酵周期的确定
  • 消前pH、摇瓶转速以及摇瓶装量进行正交设计实验
  • 变温(4/5d)对产素的影响
  • (不)加玻璃珠对生物量和产量的影响
  • 3、初始浓度葡萄糖、磷酸盐对菌体和产量的影响,磷酸盐对葡萄糖的利用的影响
  • 葡萄糖效应:补糖时间的确定(流加)
  • 4、补加前体物质的影响:加入时间和量
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5、接种方式的影响:种子(挖块、菌丝、孢子)、发酵(一级和二级种子)(阿维霉素)5、接种方式的影响:种子(挖块、菌丝、孢子)、发酵(一级和二级种子)(阿维霉素)
  • 6、短链脂肪酸(乙酸、丙酸等)作为缓效碳源加入时间的确定及影响
  • 7、DO、OUR、CER、RQ的相关分析
  • 8、硝酸铵(促进生长,降低产量)、磷酸二氢钾(调节PH,ATP、磷酸酶)、正丙醇的影响
  • 9、混合脂肪酸代替豆油 (螺旋霉素)
  • 10、流加补料的时间、速率,
  • 分批补料
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初筛(菌块—TLC法)
  • 步骤:涂布 培养 浸提 点样 层析 显色 比较

(1、原理:斑点的有无和深浅

(2、验证颜色的深浅与浓度相关(即可行性)

(3、展开剂的选择(甲醇/丙酮)

(4、检测最低浓度、检测范围的确定

(5、琼脂块的大小的确定

设想:如果培养基中含有在含脂肪,以中性红为检测剂,测定脂肪酶的活性(产量和颜色成正比)

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复筛(HPLC法)
  • 发酵液的预处理:(油的多少)
  • 发酵液 离心 弃上清 浸提 离心 微孔滤膜过滤 HPLC
  • 根据分离度、拖尾因子确定:流动相、流速、进液量,检测波长。
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前体的推测研究
  • 根据大环内酯类青霉素为例:(聚酮反应)
  • 分支氨基酸和植物油分解产生短链脂肪酸
  • (1)Asp、Gly、Met、Leu、Val是丙酰CoA的来源。
  • 异丁酸、丙酸、乙醇、甲醇、异丙醇、正丙醇、乙酸铵、丙酸钠、丁酸钠、柠檬酸钠形成乙酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙酰CoA等前体
  • (2)最佳前体不同浓度和补加时间、补加方式的影响
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提取条件的优化:
  • 单一溶媒(甲醇、丙酮、乙腈等)
  • 混合溶媒提取(乙酸乙酯的作用)
  • 提取时间
  • 提取方法(超声波、静置)
  • 萃取次数
  • 被提物的选择取(发酵液、菌体)
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高产菌株生理特性的描述
  • 菌落形态、菌丝形态、遗传稳定性、
  • 生化特性:
  • 生物量的测定:干重法,测核酸

还原糖的测定:DNS法

  • 可溶性氨基氮的测定:甲醛法/纳氏试剂分光光度法
  • 磷酸盐的测定:氯化亚锡分光光度法
  • 酸价的测定:游离脂肪酸的含量
  • 效价、PH及其他系数的测定
  • 成分A、D比重
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植物油在大环内酯类抗生素中应用
  • (1)疏水性作为缓效碳源避免葡萄糖效应
  • (2)为短链脂肪酸的来源,为聚酮类提供前体
  • (3)分解为脂肪酸和甘油分别经β-氧化,EMP途径合成乙酰辅酶A
  • (4)消泡剂
  • (5)避免使用黄豆饼粉,粘度大,产泡多
  • (6)过量产生脂肪酸使PH下降
  • (7)磷酸镁的影响?
  • (8)稳定剂对油的利用
  • (9)甲基丙二酰CoA羧基转移酶、柠檬酸脱氢酶、脂肪酶活性大小
  • (10)脂肪酸种类、饱和程度、添加量和时间的影响
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分批发酵动力学
  • 测定生物量、培养液PH、葡萄糖消长、效价的变化趋势利用MATLAB软件对实验数据进行非线性拟合出细胞动力学模型、基质消耗动力学模型、产物生成动力学模型.
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