Likvor v diferenci ln diagnostice roztrou en skler zy l.jpg
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 44

Likvor v diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy PowerPoint PPT Presentation


  • 491 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Likvor v diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy. David Zeman 1,2 , Ludmila Nováčková 1 1 ÚKB a 2 Neurologická klinika FN Ostrava. Obecné schéma likvorové diagnostiky. STATIMOVÝ PROGRAM: vzhled před centrif., po centrifugaci počet elementů a ery ve FR Hb (kvalit.), Pandy

Download Presentation

Likvor v diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Likvor v diferenci ln diagnostice roztrou en skler zy l.jpg

Likvor v diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy

David Zeman1,2, Ludmila Nováčková1

1ÚKB a 2Neurologická klinika FN Ostrava


Obecn sch ma likvorov diagnostiky l.jpg

Obecné schéma likvorové diagnostiky


P ehled metod likvorov diagnostiky l.jpg

STATIMOVÝ PROGRAM:

vzhled před centrif., po centrifugaci

počet elementů a ery ve FR

Hb (kvalit.), Pandy

CB, glukóza, laktát

cytologický preparát

IMUNOCHEMICKÁ VYŠ. - základní panel:

Q-Alb (Alb-CSF/Alb-S)

Q-IgG, Q-IgM, Q-IgA, výpočet lokální (intrathékální) syntézy

oligoklonální IgG (izoelektrická fokusace se specifickou detekcí IgG)

Přehled metod likvorové diagnostiky


Likvorov diagnostika u rs pozitivn csf v diagnostick ch krit ri ch l.jpg

Likvorová diagnostika u RS: „pozitivní CSF“ v diagnostických kritériích

  • Poser a kol. 1983: „laboratorní podpora“ dg. RS = průkaz oligoklon. IgG pásů v likvoru nebo zvýšené syntézy IgG v CNS (IgG index); „OCB nesmí být v séru a sérová koncentrace IgG musí být normální“

  • McDonald a kol. 2001: oligoklon. IgG pásy v moku nepřítomné v séru, detekované nejlépe metodou IEF, a/nebo zvýšený IgG index; lymfocytární pleocytóza <50 buněk/μl; pozitivní CSF obligátní pro podporu diagnózy primárně progresívní RS

  • Polman a kol. 2005: pro diagnózu primárně progresívní RS nemusí být pozitivní CSF, je-li pozitivní MR mozku (9 T2 lézí nebo  4 léze + pozitivní VEP) i MR míchy (2 fokální T2 léze)

  • Podle všech 3 uvedených diagnostických kritérií je vyšetření CSF pro diagnózu RS potřebné pouze v určitých vyjmenovaných situacích


Diagnostick krit ria rs rozprost enost v prostoru l.jpg

Klinický průkaz  2 lézí

MR – 3 ze 4 kritérií:

1 Gd-enhancující léze nebo 9 T2-hyperintenzních lézí

1 infratentoriální léze

1 juxtakortikální léze

3 periventrikulární léze

Při pozitivním likvoru je kritérium naplněno, jsou-li na MR 2 ložiska kompatibilní s diagnózou RS !!!

Diagnostická kritéria RS: rozprostřenost v prostoru


Diagnostick krit ria prim rn progres vn rs l.jpg

Diagnostická kritéria primárně progresívní RS

  • Progrese nemoci 1 rok a zároveň 2 z následujících 3 kritérií:

  • Pozitivní MR mozku (9 T2 lézí nebo 4 T2 léze a zároveň pozitivní VEP)

  • Pozitivní MR míchy (2 fokální T2 léze)

  • Pozitivní likvor


Likvorov diagnostika rs l.jpg

Praxe v ČR: každý pacient se susp. RS má vyšetřen likvor – i v případech, kdy to mezinárodní diagnostická kritéria nevyžadují

Podobný postoj v SRN – podle směrnic DGN (www.dgn.org) „vyšetření likvoru hraje v diagnostice RS nadále ústřední roli, zejm. slouží k odlišení od infekčních nemocí (např. borreliózy), lokální syntéza IgG a IgM poukazuje na chronický zánětlivý proces a má i význam prognostický“

ROZSAH VYŠETŘENÍ:

Směrnice DGN (www.dgn.org): cytologie, Q-Alb, Q-IgG, Q-IgM, Q-IgA, oligoklonální IgG, AI pro neurotropní viry (MRZ reakce), při klinickém podezření též AI pro borrelie

Směrnice DGLN (www.dgln.de): počet buněk a jejich diferenciace, CB, Q-Alb, ith. syntéza IgG, IgM, IgA, oligoklon. pásy, AI (M, R, Z, borrelie) jsou obligátní testy; laktát a Q-glukosy jsou fakultativní testy

Likvorová diagnostika RS


Doporu en pro likvorovou diagnostiku rs l.jpg

Doporučení pro likvorovou diagnostiku RS

  • Andersson a kol. 1994: CSF in the diagnosis of MS: a consensus report: komplexní zpracování problematiky, pro detekci intrathék. syntézy IgG doporučena IEF se specifickou detekcí IgG

  • Freedman et al. 2005: Recommended standard of CSF analysis in the diagnosis of MS: nejdůležitějším vyšetřením je detekce oligoklonálního IgG metodou IEF s následnou imunodetekcí (blotting nebo fixace)

  • Franciotta et al. 2005: Consensus recommendations of the Italian Association for Neuroimmunology for immunochemical CSF examination

  • Link, Huang 2006: Oligoclonal bands in multiple sclerosis cerebrospinal fluid: An update on methodology and clinical usefulness


Likvorov diagnostika rs cytologie l.jpg

Počet buněk: - v 60 % mírně zvýšen (4-50/μl) - vzácně (cca 1 %) mezi 50-100/ μl - hodnoty nad 100/μl diagnózu RS zpochybňují! (neuroinfekce)

Diferenciální cytologie: - většinou lymfocytární reakce, <10 % aktivovaných B-lymfocytů a plazmocytů - vzácněji monocytární reakce nebo (10-15 %) normální cytologický nález -nikdy významné zastoupení segmentů

Likvorová diagnostika RS - cytologie


Cytologick n lezy u rs l.jpg

Cytologické nálezy u RS


Cytologick n lezy u rs ii lipof g vlevo p nit bu ka vpravo l.jpg

Cytologické nálezy u RS II.lipofág (vlevo), pěnitá buňka (vpravo)


Likvorov diagnostika rs biochemie a imunochemie l.jpg

Celková bílkovina: normální nebo mírně zvýšená (<0,80 g/l)

Q-Albumin (CSF/S)*103: - v 70-80 % normální - vzácněji mírně zvýšen (<10) - vzácně mezi 10 – 20

Glukosa (CSF/S) a laktát: pro dg. RS fakultativní parametry (ale mohou být užitečné v diff. dg.)

Intrathékální syntéza imunoglobulinů: - IgG (kvantitativně cca v 70-75 % případů, kvalitativně v 90 – 98 % případů) - IgM (pravděpodobnost agresívnějšího průběhu nemoci u RR a SP formy) - IgA (<10 % případů; je-li dominantní  pochybnosti o diagnóze RS)

Likvorová diagnostika RS – biochemie a imunochemie


50 let oligoklon ln ho igg holmoy t eur neurol 2009 62 311 315 l.jpg

50 let oligoklonálního IgGHolmoy T. Eur Neurol 2009, 62: 311-315

  • CSF pacienta s SSPE:

    subfrakce 1 - 4 (Karcher et al. 1959)

    Elfo v agarovém gelu


50 let oligoklon ln ho igg holmoy t eur neurol 2009 62 311 31514 l.jpg

50 let oligoklonálního IgGHolmoy T. Eur Neurol 2009, 62: 311 - 315

  • První jasný průkaz oligoklonálního IgG v CSF (Lowenthal et al. 1960) – elfo v agarovém gelu

  • Pozitivní oligoklonální pásy u RS  v patogenezi RS se uplatňují klonálně expandované lymfocyty

  • 1 = RS; 2 = SSPE;

    3 = normální kontrola;

    4 = neurosyfilis;

    5 = afr. trypanosomiáza


Oligoklon ln igg vlevo a fklc vpravo u pacienta s sspe vlastn v roba kbld 1 lf uk praha 2002 l.jpg

Oligoklonální IgG (vlevo) a fKLC(vpravo) u pacienta s SSPEvlastní výroba - ÚKBLD 1. LF UK Praha 2002

  • AFINITNÍ IMUNOBLOTTING

  • IgG: Sw anti-Hu IgG antisérum pro potah a Sw anti-Hu IgG: HRP (Sevapharma) pro detekci

  • fKLC: metoda s kombinací anti-Hu fKLC polyklonální Ab pro potah a polyklonální anti-Hu(f+b)KLC:HRP (DAKO) pro detekci (Lamers et al., 1995): problém křížové reaktivity


Igg quantity versus quality l.jpg

IgG: „Quantity versus quality“

Hodnocení: Typ 2 – intrathékální syntéza.

Komentář:V moku 3 pásy v perineutr.

oblasti bez sérového korelátu. Proká-zána lokální produkce oligoklon. IgG.


Oligoklon ln igg dnes ief imunofixace v gelu sebia l.jpg

Oligoklonální IgG dnes IEF + imunofixace v gelu (SEBIA)

  • Pozice 4: Dívka 15 let, dg: inoperabilní míšní nádor

  • CSF: 44/3 elem, cytol.prep. - 90 % lymfo, 2 % plazmo, 8 % mono; CB 0,28 g/l, glukosa 3,3 mmol/l, Q-Alb*103 4,00, ith. syntéza IgG výpočtem neprokázána, ale 11 OCB v moku bez sérového korelátu

  • Revize dg: RS


Oligoklon ln igg 5 typ podle mezin rodn klasifikace l.jpg

OLIGOKLONÁLNÍ IgG5 typů podle mezinárodní klasifikace

  • TYP 1: normální (negativní) nález – žádné pásy v moku ani v séru

  • TYP 2: lokální (intrathékální) syntéza - 2 pásy v moku, žádné pásy v séru

  • TYP 3: lokální (intrathékální) syntéza + „systémová“ syntéza: 2 pásy v moku, které nejsou v séru + společné pásy v moku i v séru

  • TYP 4: „systémová“ syntéza, pasívní přestup sérového oligoklonálního IgG do moku; žádná intrathékální syntéza!! – společné pásy v moku a séru

  • TYP 5: obraz paraproteinu – společné pásy v moku a séru (blízko sebe, intenzita stoupá směrem ke katodě)


Oligoklon ln igg hrani n n lezy l.jpg

Oligoklonální IgG – „hraniční“ nálezy

  • 1 pás v moku  typ 1 - není intrathékální syntéza (doporučení DGLN)

  • Z toho nepřímo vyplývá: 1 společný pás v moku i v séru  typ 1 (není OLIGOklonalita)

  • Ale: 1 společný pás v moku i v séru + 1 pás v likvoru bez korelátu v séru  typ 1 nebo typ 4 ?

  • Migrační mikroheterogenita: typ 1 nebo typ 4 ? (v žádném případě nejde o intrathékální syntézu)


Oligoklon ln igg p klady l.jpg

Oligoklonální IgG - příklady


P klad likvorov ho n lezu u rs l.jpg

Příklad likvorového nálezu u RS

  • 32/3 elem

  • CB 0,246 g/l

  • CSF-albumin 112 mg/l

  • CSF-IgG 112 mg/l

  • S-albumin 39 g/l

  • S-IgG 11,2 g/l

  • Q-Alb 2,87*10-3

  • Q-IgG 10*10-3

  • oligoklonální IgG: 18 pásů v moku, 0 v séru


P klad likvorov ho n lezu u rs cytologie l.jpg

Příklad likvorového nálezu u RS: cytologie

  • lymfocyty 77 %, plazmocyty 4 %, monocyty 19 %

  • Nečetné aktivované lymfocyty a monocyty, ojedinělé mírně atypické lymfocyty v.s. v rámci zánětlivé aktivace

  • Závěr: Lymfocytární pleocytóza s plazmocytární reakcí – obraz nehnisavého zánětu, výtečně kompatibilní i s uvedenou dg. RS.


Oligoklon ln igg dynamika n lezu p pad 1 l.jpg

Oligoklonální IgG – dynamika nálezu: případ 1

  • Vlevo: 17. 9. 2009: 7 pásů v moku, 5 v séru - typ 3

  • Vpravo: 14. 5. 2010: 7 pásů v moku, 4 v séru - typ 3

  • Neměnná poloha a počet pásů podporují dg. RS

  • … ale POZOR! Lze srovnávat pouze stejnou metodu na stejném pracovišti !!!


Likvorov diagnostika rs specifick protil tky mrz reakce l.jpg

MRZ reakce: protilátky proti virům spalniček (Measles), zarděnek (Rubella) a varicella Zoster s výpočtem lokální protilátkové syntézy – protilátkového indexu (antibody index – AI): průkaz polyspecifické imunitní odpovědi – RS, systémová autoimunita s postižením CNS (zde diff. dg.: autoprotilátky v séru), větší specificita pro RS než u oligoklonálního IgG (negat. u chron. neuroinfekcí, NMO, PND)

U pacientů s RS jsou zvýšené hodnoty AI:

M 78 %, R 65 %, Z 55 %; MRZ > 90 % (pozitivita protilátek k 1-3 antigenům)

V průběhu RS se může pozitivita objevit nově a

zvýšený M-AI je spojen s rychlejší progresí nemoci (Petereit, Reske 2005)

M a R protilátky významnější pro diagnostiku RS než Z (Brettschneider a kol. 2009)

Intrathék. syntéza antiborre- liových protilátek (AI): dif. dg. význam (může však být i v rámci polyspecifické imunitní odpovědi u RS)

Likvorová diagnostika RS – specifické protilátky, MRZ reakce


Co pot ebujeme v d t pro v po et intrath k ln synt zy ig l.jpg

Co potřebujeme vědět pro výpočet intrathékální syntézy Ig

  • Kvocient albuminu Q-Alb = CSF-Alb/S-Alb

  • Kvocient IgG, IgA, IgM (obecně každého plazmatického proteinu) Q-IgX = CSF-IgX/S-IgX

  • IgG, IgA, IgM index = Q-IgX/Q-Alb

  • Historické metody výpočtu intrathékální syntézy Ig: a) extendovaný Ig index (Öhman): Q-IgX/(Q-Alb)a

    b) Tourtellotův vzorec: [(CSF-IgG – (S-IgG/615))-(CSF-Alb – (S-Alb/291))*(S-IgG/S-Alb)*0,43)]*5 = intrathékální syntéza IgG v mg/den

  • Q-Alb > Q-IgG > Q-IgA > Q-IgM ; obrácení některé z těchto nerovností svědčí pro i.th. syntézu


V po et intrath k ln synt zy ig reiberova hyperbolick funkce l.jpg

Výpočet intrathékální syntézy Ig – Reiberova hyperbolická funkce


Parametry reiberovy hyperbolick funkce l.jpg

Parametry Reiberovy hyperbolické funkce


V po et intrath k ln synt zy ig l.jpg

Výpočet intrathékální syntézy Ig

  • IgXLOC = (Q-IgX – QLim-IgX) x S-Ig [mg/l ]

  • IgXIF = 1 – (QLim-IgX/Q-IgX) x 100 [%]

  • Podle intrathékální frakce IgXIF posuzujeme dominanci intrathékální Ig syntézy v jednotlivých třídách (např. ith. IgM = 80%, ith. IgG = 25%: IgMIF > IgGIF)


Protil tkov index ai reiber a lange 1991 l.jpg

Protilátkový index (AI)(Reiber a Lange 1991)

  • AI = Q-Ig spec/Q-Ig, je-li Q-IgQ-lim

  • AI = Q-Ig spec/Q-lim, je-li Q-Ig>Q-lim

  • AI  1.5 svědčí pro lokální (intrathékální) syntézu specifických protilátek


Specifick oligoklon ln igg l.jpg

Specifické oligoklonální IgG

  • IEF  afinitní imunoblotting na membránu inkubovanou s relevantním antigenem (neuroinfekce – HSV, M. tuberculosis, borrelie, …; RS – řada perspektivních Ag-ů /neurotropní viry, složky myelinu, … /, přesto dodnes neznáme antigenní specifitu většiny lokálně syntezovaného IgG)

  • Postup: 1. Potah membrány roztokem relevantního antigenu (6-24 hod), 2. Blokování volných vazebných míst (30-90 min – v průběhu IEF), 3. Blotting (30-60 min), (4. fixace 0,1% - 0,25% glutardialdehydem), 5. Inkubace membrány se značenou protilátkou ( 60 min), 6. Detekce


Slide32 l.jpg

Oligoklonální IgG (vlevo) a oligoklonální antiborreliové IgG (vpravo) nahoře: 1. vzorek (9/2007) dole: 2. vzorek (8/2008)


Nehnisav neuroinfekce i kl ov meningoencefalitida l.jpg

Nehnisavé neuroinfekce I. Klíšťová meningoencefalitida

1. LP (13. 6. 2000): CSF lehce zkal., po centrif. čb

906/3 elem, 80/3 ery, CB 0.91 g/l, glukóza 4.25 mmol/l,

laktát 1.95 mmol/l

Kontrolní LP (10. 7. 2000): CSF čb, 167/3 elem, 5/3 ery, CB 0.55 g/l, glukóza 2.9 mmol/l, Q-Alb 7.2, i.th. IgG 43% (38 mg/l), i.th. IgM 94% (91 mg/l), i.th. IgA 0%


Nehnisav neuroinfekce ii l.jpg

Nehnisavé neuroinfekce II.

  • Muž 64 let, meningo- polyradikuloneuritický sy.

  • CSF: čb, 728/3 elem, 2/3 ery, cytologie: Ly 88%, Plb 7%, Mo 4.5%, Neu 0.5%

    CB 1.26 g/l, glukóza 4.2 mmol/l, laktát 2.3 mmol/l, Q-Alb 19.2, i.th. IgG 30% (78 mg/l), i.th. IgM 63% (16 mg/l), i.th. IgA 0%, fLC-index 7, oligo-f LC pozitivní.


Diferenci ln diagnostika obraz nehnisav ho z n tu l.jpg

Diferenciální diagnostikaObraz nehnisavého zánětu

  • Roztroušená skleróza: pleocytóza mírného stupně, popř. chybí, CB a Q-Alb zprav. norm., i.th. syntéza IgG, popř. + IgM)

  • Systémová autoimunitní onemocnění s postižením CNS

  • Jiná „chronická zánětlivá onemocnění autoimunitního typu“ (NMO, PND)

  • Nehnisavá neuroinfekce

  • Reakce na parameningeální zánětlivý proces (cave spondylodiscitis, sinusitis, otitis!)

  • Mozkový absces (i.th. syntéza IgA !!)

  • Neurotuberkulóza (CB a Q-Alb , laktát , Q-glukózy , i.th. syntéza IgA !! ; PCR!)

  • Neurobrucelóza


Diferenci ln diagnostika nehnisav z n t x meningeosis lymphomatosa leukaemica l.jpg

Diferenciální diagnostikanehnisavý zánět x meningeosis lymphomatosa/leukaemica


Z v r likvorov ho vy et en l.jpg

Popis cytologického preparátu

Výsledky jednotlivých stanovení, výpočet Q-Alb, Q-Ig, intrathékální syntézy Ig v % a v mg/l, AI

Výsledek vyšetření oligoklon. IgG

Diferenciálně – diagnostický rozbor:

normální nález

nespecifické změny

zánětlivý proces (hnisavý/nehnisavý, akutní/chronický, „infekční“/autoimunitní)

nádorové postižení

krvácení do likvor. cest

Závěr likvorového vyšetření


Perspektivy i voln lehk et zce flc l.jpg

Kvantifikace v CSF: řádové rozpory v publikovaných studiích (pro fLLC až o tři řády!!), ale shoda o významně zvýšených hodnotách fKLC u RS

1) latex-enhanced nefelometrie (FreeLiteTM) – problematické v normálních likvorech 2) ELISA a) BioVendor – sendvičová metoda b) „home-made“ kompetitivní nebo sendvičové metody

fLC v moči: slibný marker aktivity nemoci (Mehta et al. 1991, 1998) – opakovaná vyšetření; nemají význam diagnostický

Oligoklonální fLC: detekce v párovém vzorku likvoru a séra a srovnání

Srovnání obou přístupů:

Diagnostický význam pro fKLC, nejasný pro fLLC

Nelze s jistotou deklarovat přednost detekce oligoklonality oproti kvantifikaci

Perspektivy I.: volné lehké řetězce (fLC)


Slide39 l.jpg

Oligoklonální IgG – negativní, typ 1 (nahoře),fKLC (dole vlevo) i fLLC (vpravo) pozitivní v CSFPacient s akutní nehnisavou neuroinfekcí


Perspektivy ii oligoklon ln igm l.jpg

Perspektivy II: Oligoklonální IgM

  • Prognostický význam u RS (RR, SP) - pozitivita implikuje agresivnější průběh nemoci

  • Prognostický význam má patrně lokální syntéza IgM proti myelinovým lipidům – fosfatidylcholinu a/nebo sfingomyelinu (RR-RS 30 %, SP-RS 60 % x PP-RS 0 %)

  • Metodicky obtížné, nicméně metoda detekce celkového i specifického oligoklonálního IgM byla publikována (Villar et al. 2001, 2005)


Oligoklon ln igm villar et al j immunol methods 2001 258 151 155 l.jpg

Oligoklonální IgMVillar et al., J Immunol Methods 2001,258:151-155

  • 50 mM DTT 30 min, RT

  • IEF, imunoblotting

  • Chromogenní detekce (BCIP/NBT) s protilátkou značenou ALP

  • A – OCB patrné až do koncentrace 0,025 mg/l (0,125 ng/pozici)

  • B – žádná křížová reaktivita s IgG


Oligoklon ln igm schneider et al eur j neurol 2007 14 907 911 l.jpg

Oligoklonální IgMSchneider et al., Eur J Neurol 2007, 14: 907-911

  • Afinitní imunoblotting, chemiluminiscenční detekce

  • Vzorky „treated with dithiothreitol to facilitate IgM migration“

  • 2 páry CSF + S vlevo pozitivní, 2 páry vpravo negativní

  • Ve všech vzorcích pozorováno „a slight separation of IgM“

  • Nekorelují s rizikem relapsu u pacientů s CIS


Oligoklon ln igm se specifitou proti myelinov m lipid m villar et al j clin invest 2005 115 187 195 l.jpg

Oligoklonální IgM se specifitou proti myelinovým lipidůmVillar et al., J Clin Invest 2005, 115: 187-195


Z v r l.jpg

ZÁVĚR

  • Nejdůležitějším vyšetřením v likvorové diagnostice RS je detekce oligoklonálního IgG

  • Zejména z diferenciálně-diagnostických důvodů je nezbytné též stanovení počtu buněk a jejich diferenciace (lépe v trvalém preparátu), Q-Alb (stav H-L bariéry), Q-IgG, Q-IgM, Q-IgA a AI (M, R, Z, popř. borrelie, HSV) k posouzení intrathékální syntézy „celkových“ i specifických protilátek

  • Perspektivními testy jsou stanovení/detekce volných lehkých řetězců, oligoklonální IgM a různé specifické protilátky (AI, oligoklonální specif. protilátky)

  • V blízké budoucnosti lze čekat upřednostnění detekce oligoklonálních IgM, IgA a fLC pásů před výpočty intrathékální syntézy


  • Login