การวินิจฉัยโรคปรสิตจากตัวอย่างเลือด

1. การวินิจฉัยโรคปรสิตจากตัวอย่างเลือดการวินิจฉัยโรคปรสิตจากตัวอย่างเลือด • โรคปรสิตบางชนิดสามารถตรวจวินิจฉัยได้จากตัวอย่างเลือดที่ได้จากผู้ป่วย โรคที่สำคัญได้แก่ โรคมาลาเรีย (malaria) , • โรคเท้าช้าง (filariasis) และ • โรคอาฟริกันเหงาหลับ • (African sleeping sickness)

2. - ได้มีการพัฒนาการตรวจวินิจฉัยโรคเหล่านี้ทางวิธี อิมมูนวิทยา - แต่ก็ยังพบว่าการตรวจหาปรสิตโดยวิธีตรวจดูเชื้อ ปรสิตจากฟิล์มเลือดโดยตรงยังเป็นวิธีที่ประหยัด และเชื่อถือได้ - ในการศึกษาวิชาปรสิตความรู้ในการเก็บตัวอย่าง เลือดและการเตรียมเลือดเพื่อตรวจวินิจฉัยโรค ปรสิตนี้จึงถือเป็นความรู้พื้นฐานที่จะช่วยในการ ศึกษาและวิจัยงานทางด้านปรสิตต่อไป

3. การเก็บตัวอย่างเลือด ส่วนใหญ่ทำกันอยู่ 2 วิธี คือ 1. ใช้ตัวอย่างเลือดน้อย เจาะเลือดจากปลายนิ้ว 2. ใช้ตัวอย่างเลือดมาก เจาะจากเส้นเลือดดำ บริเวณหน้า แขน และจะต้องเก็บเลือดไว้ในสารที่ ป้องกันการแข็งตัวของเลือด (anticoagulant) เช่น calcium oxalate, EDTE heparin

4. การเจาะเลือด วัสดุ 1. กระจกสไลด์ที่สะอาด ไม่มีฝุ่นหรือไขมันจับ 2. เข็ม หรือเครื่องมือเจาะเลือดจากปลายนิ้ว (lancet) 3. 70% alcohol 4. สำลี

5. วิธี 1. ใช้สำลีชุปแอลกอฮอล์ (alcohol) เช็ดบริเวณ ปลายนิ้วที่จะเจาะ 2. เจาะปลายนิ้วนางหรือนิ้วกลาง (เจาะบริเวณ ด้านข้างของ นิ้ว จะเจ็บน้อยกว่าเจาะตรง กลางนิ้วเนื่องจากบริเวณนั้นมีเส้นประสาท น้อยกว่า) 3. เจาะปลายนิ้วด้วยเข็มเจาะ

6. 4. บีบปลายนิ้วผู้ป่วยเล็กน้อยให้เลือดไหล แล้ว เช็ดออกด้วยสำลีที่แห้ง 5. บีบเลือดออกมาใหม่แล้วใช้กระจกสไลด์คว่ำ ลงไปแตะหยดเลือดที่ปลายนิ้ว

7. การทำฟิล์มบางบนกระจกสไลด์ (thin smear) 1. วางปลายกระจกสไลด์ที่สะอาดแผ่นหนึ่งลงบน กลางแผ่นสไลด์ที่มีเลือดอยู่ (หยดเลือดควรอยู่ บริเวณปลายสไลด์) 2. ลากกระจกสไลด์กลับจนมาแตะกับหยดเลือด 3. ปล่อยให้เลือดกระจายออกบนขอบกระจกสไลด์

8. 4. ดันกระจกสไลด์ไปข้างหน้าช้าๆอย่างนิ่มนวล โดยให้แรงดันสม่ำเสมอ เลือดจะกระจายไปตาม ทางการเคลื่อนที่ของกระจกสไลด์ 5. ควรได้แผ่นฟิล์มที่มีปลายมนไม่ยาวและสั้นเกินไป แผ่นฟิล์มเลือดที่ดีจะต้องเรียบ เลือดกระจายออกเป็น ระเบียบ ส่วนต้นจะหนาส่วนปลายจะบางเรียบ เมื่อดู ด้วยกล้องจุลทรรศน์เม็ดเลือดจะเรียงตัวกันเป็น ระเบียบ เมื่อได้แผ่นฟิล์มแล้วปล่อยให้แห้งที่ อุณหภูมิห้อง หรืออังเปลวไฟ แล้วนำไปย้อมสี

10. การทำฟิล์มหนาบนกระจกสไลด์การทำฟิล์มหนาบนกระจกสไลด์ 1. แตะเลือดบนส่วนกลางของกระจกสไลด์ให้มากพอควร 2. ใช้มุมด้านหนึ่งของกระจกสไลด์อีกแผ่น กวนเลือดเป็น วงกลมทางเดียวกัน ให้เลือดกระจายออกเป็นแผ่นบางๆ สม่ำเสมอ เส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 1.5 - 2 ซม.

11. 3. แผ่นฟิล์มเลือดที่ดีต้องไม่หนาหรือบางจนเกินไป เพราะจะทำให้การย้อมสีไม่ดีเท่าที่ควร 4. แผ่นฟิล์มที่เตรียมเสร็จตั้งทิ้งไว้ให้แห้งในอุณหภูมิห้อง

12. การย้อมสีแผ่นฟิล์มเลือดการย้อมสีแผ่นฟิล์มเลือด • สีที่ใช้ย้อมแผ่นฟิล์มเลือดมีหลายชนิด ที่นิยมใช้ได้แก่ Giemsa stain และ Field rapid stain สามารถย้อมได้ทั้งแผ่นฟิล์มบางและหนา

13. การย้อมสีด้วยสี Giemsa’s stain วัสดุและอุปกรณ์ 1. แท่งแก้วสำหรับวางกระจกสไลด์ 2 แท่ง 2. ถาดวางแท่งแก้ว 3. Methanol 4. Buffer water 5. Giemsa’s stain

14. วิธีการ 1. เตรียม buffer water Na2HPO4.2H2O 3.76 กรัม KH2PO4 2.10 กรัม ละลายสารในน้ำกลั่น 100 ml ให้ละลายหมด แล้วเติมน้ำให้ครบ 1000ml วัด pHให้ได้pH ระหว่าง 7.0-7.2 ( ปรับpH ด้วย 0.2% sodium carbonate เมื่อสารละลายเป็นกรด , ปรับด้วย 0.5% acetic acid เมื่อสารละลายเป็นด่าง )

15. 2. การเตรียมสี Giemsa’ s stain Giemsa’s stain powder 0.75 กรัม Methanol 65 ml Glycerol 35 ml ละลายสีใน glycerol ที่ละน้อยจนละลายหมด นำไปอุ่นที่ 60o c 10 - 12 ชั่วโมง คอยให้เย็นแล้วเติม methanol ลงไป เขย่าให้เข้ากัน ดูว่าสีละลายหมด กรองสีด้วยกระดาษกรอง ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิ 37oc 1 - 2 สัปดาห์ ก่อนใช้ทำให้เจือจางด้วย buffer water ประมาณ 2 - 5 %

16. 3. วิธีย้อมสีฟิล์มเลือด 3.1 ย้อมสีฟิล์มหนาย้อมได้เลย ย้อมสีฟิล์มบางต้อง เอาสไลด์ไปผ่าน methanol ก่อนโดยจุ่มฟิล์ม เลือดชนิดบางลงใน methanol 1 - 2 นาที 3.2 วางกระจกสไลด์ที่มีฟิล์มเลือดลงบนแท่งแก้ว ซึ่งวางอยู่บนถาด

17. 3.3 หยดสีที่เตรียมไว้ ทิ้งไว้ 30 นาที 3.4 ล้างสีโดยจุ่มกระจกลงใน buffer water แกว่งสไลด์เบาๆใน buffer water 3.5 ล้างกระจกสไลด์ด้วยน้ำธรรมดา แช่น้ำไว้ประมาณ 2 - 3 นาที เพื่อละลาย haemoglobin ออกจาก เม็ดเลือดแดง นำสไลด์ไปตรวจใต้กล้องจุลทรรศน์

18. การย้อมด้วยสี Field rapid stain วัสดุและอุปกรณ์ 1. กระบอกแก้ว ( staining jar ) 3 อัน 2. กระบอกแก้วใส่น้ำล้างสี 2 อัน 3. สี Field stain “A” 4. สี Field stain “B” 5. Methanol

19. วิธีการ 1. เตรียมสี Field stain “A” Methylene blue 1.6 กรัม Azur I 1.0 กรัม Na2HPO4 10 กรัม KH2PO4 12.5 กรัม

20. ละลาย Na2HPO4และ KH2PO4 ในน้ำกลั่น 700 ml แล้วเติมน้ำให้ครบ 1000 ml เทสารละลายที่ได้ลงในกระบอกแก้ว แล้วเติมสารละลายตัวอื่นๆจนหมด ผสมให้เข้ากัน กรองด้วยกระดาษกรอง เก็บไว้ใช้ได้นาน

21. 2. เตรียมสี Field stain “B” Eosin 2 กรัม Na2HPO4 10 กรัม KH2PO4 12.5 กรัม ละลาย Na2HPO4 และ KH2PO4 ในน้ำกลั่น 1000 ml ใส่สี Eosin คนให้ละลาย กรอง เก็บไว้ในขวด

22. 3. วิธีย้อมสีฟิล์มเลือด • 3.1 ย้อมสีฟิล์มหนาย้อมได้เลย ย้อมสีฟิล์มบางต้อง • เอาสไลด์ไปผ่าน methanol ก่อนโดยจุ่มฟิล์ม • เลือดชนิดบางลงใน methanol 1 - 2 นาที • 3.2 สำหรับฟิล์มหนา จุ่มสไลด์ลงในสีย้อม • Field stain “A” 20 วินาที ล้างสีด้วยน้ำโดย • แกว่งในน้ำเบาๆ • จากนั้นย้อมด้วย สี Field stain “B” 10 วินาที ล้างน้ำ

23. 3.3 ฟิล์มบาง จุ่มสไลด์ในสี Field stain “B” 10 • วินาที ล้างสีด้วยน้ำ แล้วจึงย้อม • ด้วยสี Field stain “A” 20 นาที ล้างสีด้วยน้ำ • 3.4 นำสไลด์ไปตรวจใต้กล้องจุลทรรศน์

24. RBC WBC