Ejercicio en Mapas de Restricci ón

1. Ejercicio en Mapas de Restricción Laboratorio 5 Biol 3030 –LaboratorioBiología del Desarrollo JACarde, PhD

2. Objetivos • Introducción de principiosbásicos de mapas de restricción • Discusiónteórica de comoprepararmapas de restricción • Uso de simulaciones y bioinformáticaparapreparar un mapa de restricciónasignado.

3. Plásmidos • Son moleculaspequeñas de DNA, de configuración circular, extracromosomales • Por lo general encontrados en organismos simples comoE coli, algas y levaduras. • Puedenvariar en tamaños: pocos miles ha varioscientos de miles de pb • Se replicanusandosupropioorigen de replicación y susproteínas, y puedentransferirse a otrascélulasporconjugación.

4. Plásmidos • Comunmentecontienen genes quecodificanpararesistencia a uno o mas antibióticos, asiconfierenresistencia a sushospederos, de ahísuimportanciaclínica. • Usadosporbiólogosmolecularescomovectoresquecontienenfragmentos de DNA ajenosligados, insertados o clonados en ellos. • Finalmente, puedenseraisladosindependientes del genomabacterianoporsutamaño.

5. Plásmidos • Un mapa de plásmido incluye información básica sobre: • 1) el tamaño • 2) los genes presentes • 3) el origen de replicación • 4) los lugares de restricción para enzimas. • La molécula es circular, asi que hay un 0 arbitrario y todos los lugares de restricción son indicados con un número entre 0 y el total de pb en el plásmido.

6. Plásmidos • Los tamaños de los fragmentos se calculan restando o sumando los puntos en el plásmido. • El nombre del plásmido y su tamaño aparece en el centro del circulo. • El origen de replicación aparece marcado como Ori, el gen para beta-lactamasa (enzimas que confiere la resistencia contra ampicilina) y la localización para el DNA de bacteriófago lambda son mostradas

7. Enzimas de restricción • Tambiénconocidascomoendonucleasas de restricción • Reconocensecuenciasespecíficas de bases en el DNA DS y lascortan en lugaresespecíficos en ambashebras • Hidrolizan el enlaces fosfodiester en cadahebra • Reconocensecuencias de 4- 8 pb • Son secuenciaspalindrómicas • Leen los mismo en ambashebras en la mismadirección 53

8. Enzimas de restricción • Las flechasindican los puntosdonde se rompe el enlace fosfodiesterico • Unavez el esqueletoazucar-fosfatoesroto los enlaces de H no son suficienteparamantener la doblehebra y se separan.

9. IngenieríaGenética • Unaimportanteaplicación de lasenzimas y los plasmidoses la clonación. • El DNA de organismosdistintos se puedemanipularcortándolo con enzimas • Fragmentos de organismosdistintoscortados con la mismaenzima se puedenunir o ligar • Gen quimérico o clono • Introducirse en otroorganismo y expresarse

10. Sticky and Blunt Ends; 2 enzymes

11. Sticky ends, one enzyme

12. Sticky ends, one enzymeTransformationCultureAntibiotic

13. Mapas de Restricción • Poderosatécnica de biología molecular paraanalizarmoléculas de DNA usandoenzimas de restricción • 1979 Nathans, Smith y Arber ganan Nobel pordescubrirlas y aplicarlas de forma creativa a los mapas de genes.

14. Paso para la construcción de un mapa de restricción - Figura1 muestra el DNA de lambda digerido con la enzimaPstIparaproducirfragmentos de DNA de tamañosconocidos.- Se usanesostamañosconocidos de fragmentos de DNA paraestimar los tamaños de los fragmentosdesconocidos- Luegosume los tamaños de los fragmentosindividuales de cada digestion paradeterminar el tamaño original del DNA sin cortar.- Luego determine el numero de vecesquecadaenzimacorta el DNA y la distancias entre los cortes.- Finalmente determine dondeubican los sitios de corte, relativosunos a otros.

15. El DNA desconocidofuesometido a 4 distintasdigestiones (Fig 1). • Tresenzimas de restricción se usaron: HpaI, PstI, and SspI. • Muestras de nuestro DNA se incubaron con HpaI sola, Hpa1 y PstI, Hpa1 y SspI o HpaI, PstI y SspI • La digestiones simples ayudan a deducir el número de lugaresparacortespresentes en la molecula. • Las digestionesdoble y triples permitenubicar los sitios de cortesunosrelativos a otros.

16. Paso a Paso • 1. Estimar los tamaños de los fragmentos de DNA en pb al compararlos con los fragmentosrotulados del marcador(la digestián de DNA lambda con PstI) No tienenquesertamañosexactos. Determinartamaños de fragmentospequeñoses mas precisoqueparatamañosgrandes. • 2. Determinar el tamaño total del DNA digeridosumando los tamaños de los fragmentos de cadadigestión. Usar los tamaños de lascuatrodigestiones. Recuerdeque el mismo DNA fuedigerido en cadamuestra, asíque los fragmentos de cadadigestióndebensumar lo mismo.

17. Paso a Paso • 3.Hay dos sitiosparaHpaIpresentes. Basándose en el número de fragmentosobtenidos de la digestión con HpaI, eseste DNA linear o circular. Dibuje la molécula con los lugaresparaHpaIilustrados • 4.Cuantos lugaresparaPstI hay presentes?

18. 5.Donde se encuentra el lugarparaPstI. Dibuja la posición del sitioPstI en el plásmido, relativo a los sitiosparaHpaI. Recuerdaque el plásmidoesunamolécula de DNA pequeña y circular. • 6.Cuantos lugareshay paraSspI? • 7.Donde estalocalizado el lugarparaSspI. Dibuje la posicón del sitoparaSspI, relativo a los de HpaI en el plásmido. Lo mejoreshacerlo en un dibujoseparado al de PstI, porque no sabemoscualrelacion hay entre ellos. • 8.Permanece el fragmento de 600 de HpaI sin cambiosluego de digestión con PstI o SspI. (Figura 1).

19. 9. Cualesfragmentos no cambian de la digestión con HpaI/PstI a la HpaI/PstI/SspI? Cualesfragmentosdesaparecen? Porquedesaparecenestosfragmentos? • 10. Cualesfragmentos no cambian de la digestión con HpaI/SspI a la HpaI/PstI/SspI? Cualesfragmentosdesaparecen? Porquedesaparecenestosfragmentos?

20. 11. Hay un fragmentoquesóloaparece en la digestión con HpaI/PstI/SspI? Quesignificaesto? • 12. Dibuja el mapa del plásmidocompleto, con todos los lugaresparalasenzimaspresentes en susposicionesrelativas.