第 10 章 吸光光度法 （ Absorption Photometry ）

1. 第10章 吸光光度法 （Absorption Photometry） 基于物质对光的选择性吸收建立起来的一种分析方法。包括比色法、紫外-可见吸光光度法和红外光谱法等。

2. 10.1　物质对光的选择性吸收和光吸收定律 10.1.1　物质对光的选择性吸收 1、光的基本性质 光是一种电磁波，具有波粒二象性，用普郎克公式可以把波性和粒性联系在一起。

3. 光的波粒二象性 光的折射 波动性   光的衍射 光的偏振 光的干涉 E 粒子性 光电效应 E：光子的能量（J,焦耳） ：光子的频率（Hz, 赫兹） ：光子的波长（cm） c：光速（2.99791010 cm.s-1） h：Plank常数（6.625610-34 J.s焦耳. 秒）

4. 光学光谱区 50 m ~300 m 200nm ~380nm 10nm~200nm 380nm ~ 780nm 780 nm ~ 2.5 m 2.5 m ~ 50 m 紫外光度法 比色及可见光度法 跃迁类型：分子中价电子的跃迁

5. 2、吸收光谱产生的原理 物质分子内部 3 种运动形式及其对应能级： 1. 电子相对于原子核的运动--电子能级; 2. 原子核在其平衡位置附近的相对振动 --振动能级; 3. 分子本身绕其重心的转动--转动能级. 　　分子吸收光谱，是由于分子中价电子选择性地吸收了某些范围内的光

6. 分子总能量：E分子＝E电子＋E振动＋E转动 分子吸收光，从基态跃迁到激发态，能量发生变化 △E分子＝ △E电子＋ △E振动＋ △E转动 1~20ev 0.05~1ev <0.05ev 若吸收光，则必须： 激发态 即：只有光的能量与分子中基态与激发态能量差相等时，物质才会吸收光。由于物质基态与激发态能量差是固定的，所以物质对光的吸收是选择性的 基态

7. S3 A h S2 E2 S1 E0 S0  E3 S2 A E1 h h h h S1 S0  吸收光谱 Absorption Spectrum 纯 电子能态间跃迁 锐线光谱 带状光谱 分子内电子跃迁

8. * 单色光（monochromatic light）：具有同一波长的光。 * 复合光（multiplex light）：由不同波长组成的光。 * 紫外光（ultraviolet light）：波长200~400 nm。 * 可见光（visible light）：人眼能感觉到的光，波长在400~750 nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的 * 波段（wave band）：各种色光的波长范围不同。 * 互补色光（complementary color light）：按一定比例混合，得到白光（white light）。 * 物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。

9. 绿 青 黄 橙 青蓝 蓝 红 紫 白光

10. 物质的颜色与吸收光的关系 复合光 光谱示意 表观现象示意 完全吸收 完全透过 吸收黄色光

11. 蓝绿 表6-2物质颜色与吸收光颜色的关系

12. 10.1.2 光吸收的基本定律----朗伯-比尔定律 1、朗伯-比尔定律 b b I’0 I’0 I0 It 浓度C Ia Ir 反射光 Ir 反射光 吸收光 空白溶液： I’0＝I0＋Ir 吸光溶液： I’0＝Ia＋It＋Ir 　把I0当作入射光， I0＝ Ia＋It 通常用 I 表示 透光度越大，溶液对光的吸收越小 定义：透光度：

13. 吸光度： 朗伯定律:(1760) A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的,吸光物质的c 一定时,溶液的吸光度 A与液层厚度 b 成正比. 比尔定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的 ,液层厚度b一定时,溶液的吸光度 A 与吸光物质的 c 成正比.

14. 朗伯-比尔定律 A=lg(I0/It)=Kbc 意义: 当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比. K：常数，与吸光物质性质、入射光波长和温 度等因素有关 光吸收具有加和性.A = A1 + A2 + 

15. 2、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度 当 c 的单位用 g·L-1 表示时，用 a 表示， A＝a b c K吸光系数Absorptivity a 的单位: L·g-1·cm-1 a ：表示每升1 g 物质，液层厚度为1 cm 时溶液的吸光度 • 当c的单位用mol·L-1表示时，用 表示.  －摩尔吸光系数 Molar Absorptivity A＝ b c  的单位: L·mol-1·cm-1 • ：表示物质的量浓度为1mol/L，液层厚度为1cm 时溶液的吸光度 • 越大，物质对光的吸收程度越大， 最大时的吸收波长即λmax，此时测定灵敏度最高。　　问：如何测 ？

16. 2+ 3 3 邻二氮菲 桔红色 508  =1.1 104 实际测定 实际测得的是条件摩尔吸收系数， ′ 一般情况  < 104 低灵敏度  ~ 104 ~105 中等灵敏度  > 105 高灵敏度

17. Sandell(桑德尔)灵敏度(S) 定义：当仪器的检测限 A=0.001时,截面积为1cm2的液层内 所能检出的物质的最低含量。 用 S 表示，单位：g·cm-2 S 与  关系 S 小，灵敏度高;  相同的物质，M 小，则灵敏度高.

18. 10.2 分光光度计及吸收光谱 10.2.1 分光光度计 可见：72、721、722、723、724 单光束、单波长 紫外-可见：751G、754 双光束、双波长

19. 0.575 光源 单色器 检测器 显示 吸收池 单波长单光束分光光度计

20. 主要部件 光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度, 稳定 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)

21. 单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。 棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同. 玻璃350～3200nm, 石英185～4000 nm • 光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。 • 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。 问：玻璃能用于紫外区吗？ • 波长范围宽, 色散均匀, • 分辨性能好, 使用方便.

22. 吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池 问：紫外区能用玻璃吗？ • 检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。 • 光电管，光电倍增管 • 显示装置（指示器）：记录A或T • 低档仪器：刻度显示 • 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录

23. 10.2.2 吸收光谱 任何一种溶液．对不同波长的光的吸收程度是不相等的。如果将不同波长的单色光依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标可以得到一条曲线，叫做吸收光谱或吸收曲线。它清楚地描述了溶液对不同波长的光的吸收情况。

24. 525 545 350 1.0 MnO4- Cr2O72- 0.8 Absorbance 0.6 0.4 0.2 /nm 300 350 400 500 600 700 光吸收曲线 Cr2O72-、MnO4- 的吸收光谱

25. 不同物质吸收光谱的形状以及max 不同 ——定性分析的基础 例如：KMnO4溶液的光吸收曲线，λmax＝525nm，如果浓度改变，吸光度改变，但吸收曲线形状不变，如下页 • 同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax 不同 ——定量分析的基础

27. 选择适当的参比溶液 原则： 扣除非待测组分的吸收 A （样） = A （待测吸光物质）+ A （干扰）+ A （池） A （参比）= A （干扰）+ A （池） 以显色反应为例进行讨论 M + R = M-R max max 若欲测 M-R 的吸收 试液 显色剂 溶剂 吸光物质 参比液组成 无吸收 无吸收 吸收 溶剂 光学透明 基质吸收 无吸收 吸收 不加显色剂的试液 无吸收 吸收 吸收 显色剂 基质吸收 吸收 吸收 显色剂 + 试液 + 待测组分的掩蔽剂

28. 10.3 显色反应及其影响因素 10.3.1显色反应和显色剂 显色反应：将待测组分转变成可测量的有色化合物的反 应，叫显色反应。 显色剂： 与待测组分形成有色化合物的试剂称显色剂。

29. （1） 显色反应的选择 A 选择性好，干扰少，或干扰容易消除;灵敏度高，有色物质的ε应大于104。 B 有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。 C 有色化合物的化学性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定。这就要求有色化合物不容易受外界环境条件的影响。 D 有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差Δλ(称为对比度)大于60 nm。

30. （2）显色剂 无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高。如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒;用H2O2显色测钛等。 有机显色剂分子中含有生色团（chromophoric group）和助色团（auxochrome group）。生色团是某些含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中的π电子被激发时需能量较小，可吸收波长200 nm以上的可见光而显色。助色团是含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。这些基团与生色团上的不饱和键作用，使颜色加深。

31. 有机显色剂 A 磺基水杨酸OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定的螯合物，主要用于测Fe3+。 B 丁二酮肟NN型螯合显色剂，用于测定Ni2+。 C 1，10-邻二氮菲NN型螯合显色剂，测微量Fe2+。 D 二苯硫腙 含S显色剂，萃取光度测定Cu2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+等。 E 偶氮胂Ⅲ(铀试剂Ⅲ)偶氮类螯合剂，强酸性溶液中测Th(Ⅳ),Zr(Ⅳ)，U(Ⅳ)等；在弱酸性溶液中测稀土金属离子。 F 铬天青S三苯甲烷类显色剂，测定Al3+。 G 结晶紫 三苯甲烷类碱性染料，测定Tl3+。

32. （3）多元络合物 多元络合物是由三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物。三元络合物在吸光光度分析中应用较普遍。重要的三元络合物类型。 * 三元混配络合物 金属离子与一种络合剂形成未饱和络合物，然后与另一种络合剂结合，形成三元混合配位络合物，简称三元混配络合物。例如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色络合物，可用于钒的测定，其灵敏度高，选择性好。

33. *离子缔合物 金属离子先与络合剂生成络阴离子或络阳离子，再与带反电荷的离子生成离子缔合物。主要用于萃取光度法。 如，Ag+与1，10-邻二氮菲形成阳离子，再与溴邻苯三酚红的阴离子形成深蓝色的离子缔合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽剂，可测定微量Ag+。 作为离子缔合物的阳离子，有碱性染料、1，10-邻二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、锑)等;作为阴离子，有X-，SCN-，ClO4-，无机杂多酸和某些酸性染料等。

34. * 金属离子-络合剂-表面活性剂体系 金属离子与显色剂反应时，加入某些表面活性剂，可以形成胶束化合物，它们的吸收峰向长波方向移动(红移)，而测定的灵敏度显著提高。目前，常用于这类反应的表面活性剂有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基苄胺、氯化十六烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵 、溴化羟基十二烷基三甲基铵、OP乳化剂。例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反应，生成三元络合物，在pH 8~9时呈蓝紫色，用于痕量稀土元素总量的测定。

35. * 杂多酸溶液在酸性的条件下，过量的钼酸盐与磷酸盐、硅酸盐、砷酸盐等含氧的阴离子作用生成杂多酸，作为吸光光度法测定相应的磷、硅、砷等元素的基础。杂多酸法需要还原反应的酸度范围较窄，必须严格控制反应条件。很多还原剂都可应用于杂多酸法中。氯化亚锡及某些有机还原剂，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亚硫酸盐和氢醌常用于磷的测定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷钼酸盐和磷钼酸盐的还原剂。抗坏血酸也是较好的还原剂。

36. 10.3.2 影响显色反应的因素 1.溶液的酸度 (1)酸度低，金属离子水解 (2) 酸度影响显色剂的浓度和颜色 (3)酸度影响络合物的组成和颜色 2、显色剂用量 3.显色时间和温度 4.溶剂 　（1）溶剂影响络合物的离解度 （2）溶剂影响显色反应的速度

37. 钍-偶氮砷III 钴-亚硝基红盐 A A 试剂 络合物 络合物 试剂 415 500 515 655 /nm /nm 10.4　吸光光度分析及误差控制 10.4.1　测定波长的选择和标准曲线的绘制 1、测定波长的选择 最大吸收原则： 选λmax的光作入射光。此时，灵敏度较高，测定时偏离朗伯-比耳定律的程度减小，其准确度也较好。 “吸收最大、干扰最小”的原则：当有干扰物质存在时，应据此来选择入射光的波长。

38. A 2. 标准曲线的制作 2 1 Ax 根据A＝εbc 作 A～C 曲线 从工作曲线上查浓度 3 1、3不通过原点，主要原因有： A、参比溶液选择不当 B、吸收池厚度不等 C、吸收池表面不清洁 C

39. 10.4.2 对朗伯-比耳定律的偏离 A＝εbc

40. 1.单色光不纯所引起的偏离 避免方法：选最大吸收波长处，　使用分光效能高的单色器 A A λ1 λ2 C λ1 λ2 λ λ1处无偏差

41. 2．介质不均匀性引起的偏离 朗伯-比耳定律是建立在均匀、非散射基础上的一般规律,如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态存在，则入射光除了被吸收之外、还会有反射、散射作用。在这种情况下，物质的吸光度比实际的吸光度大得多，必然要导致对朗伯-比耳定律的偏离。

42. 3.由于溶液本身的化学反应引起的偏离 溶液中吸光物质常因解离、缔合、形成新的化合物或在光照射下发生互变异构等，从而破坏了平衡浓度与分析浓度之间的比例关系，也就破坏了吸光度A与分析浓度之间的线性关系。产生对朗伯-比耳定律的偏离。 例：K2Cr2O7λmax=450nm 稀释，离解度增大，吸光度降低 实际测定时：可控制强酸性测Cr2O72- 或控制强碱性测CrO42-

43. 4. 显色反应的干扰及其消除 • 试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定,使得标准曲线严重偏离朗伯-比尔定律,这是造成光度分析误差的重要原因.例干扰物质本身有颜色或与显色剂反应,在测量条件下也有吸收,造成干扰.干扰物质与待测组分反应或与显色剂反应,使显色反应不完全,也会造成干扰.干扰物质在测量条件下从溶液中析出,使溶液变混浊,无法准确测定溶液的吸光度.

44. 消除干扰的方法主要有以下几种： • （1）控制酸度 • 　　许多显色剂是有机弱酸，控制溶液的酸度，就可以控制显色剂R的浓度，这样就可以使某种金属离子显色，使另外一些金属离子不能生成有色络合物。 • （2）加入掩蔽剂 • 在显色溶液里加一种能与干扰离子反应生成无色络合物的试剂，也是消除干扰的有效而常用的方法。 • (3) 改变干扰离子的价态以消除于扰。 • （4）选择合适的参比溶液. • （5）增加显色剂的用量 • （6） 分离干扰离子

45. 1.0 0 ∞ A 90100 0 10 T% 10.4.3　吸光度测量的误差 由于仪器精度不够，光源不稳、检测器、读数不准，实验条件偶然变动等引起的误差，这些误差，都反映到读数误差ΔT ΔT（绝对误差）：与T本身的大小无关，对于一台给定仪器它基本上是常数，一般在0.002-0.01之间，仅与仪器自身的精度有关。 读数标尺 T：分布均匀，A=εbc， 当T不同时，ΔA非常数，∴ΔC非常数

46. 由于T 与浓度c 不是线性关系，故不同浓度时的仪器读数误差ΔT引起的测量误差Δc/c不同。 测量误差公式推导: A = - lgT = - 0.434lnT dA = - 0.434dT/T 若：dT= ΔT =±0.01，则：

47. Er 10 8 6 (36.8) 4 2 0.434 20 40 60 80 T/% 0 0.7 0.4 0.2 0.1 A 可绘制∣Er∣～T曲线 T lgT 最大时，即(TlgT) ′= 0 时误差最小, 算得 lgT= - 0.434 , T=36.8% , A = 0.434 适宜测量范围：T：0.15～0.65 A：0.80～0.20 工作中可控制　A：0.90～0.10 通过使用不同厚度的比色皿

49. 标准系列 未知样品 10.5 其它吸光光度法 10.5.1 目视比色法 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分 方法简便，灵敏度高

50. 10.5.2 示差吸光光度法 　　分光光度法可用于测量微量组分，控制 A 在0.1～1.0之间，若浓度过大，即使不偏离比尔定律，但会使A > 1.0，无法测定。所以可采用示差法。示差法可分三种： 高浓度示差法（常用） 　　低浓度示差法 　　极限精密法