高效液相色谱法 （ HPLC ）

1. 高效液相色谱法 （HPLC）

2. 色谱法定义 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。

3. 目 录 一、液相色谱分析法的发展 二、液相色谱分析法的特点 三、液相色谱仪 四、液相色谱分析法的原理 五、高效液相色谱法的主要类型及原理 六、高效液相色谱分析法的应用 七、分离数据的处理方法 八、参考文献

4. 一、液相色谱分析法的发展 20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱。 20世纪60年代末： 　　 随着色谱理论的发展、高效细微固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用，高效液相色谱法得到了突破性的发展。

5. 类比 液柱色谱法和跑道赛跑

6. 二、液相色谱分析法的特点 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。 兼具分离和分析功能，可以在线检测。

7. 高效液相色谱法的突出特点： 1）高压（150－350*105Pa） 2）高速 3）高效 4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光 10-11g ）

8. 三、液相色谱仪（1）

9. 三、液相色谱仪（2）

10. 四、液相色谱分析法的原理 （一）高效液相色谱分析的流程 1、由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。 2、被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。 3、废液流入废液瓶。 遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度， 　　而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

11. 四、液相色谱分析法的原理 （二）高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 　　

12. 27 3 18 9 6 1 分配系数：物质在两相溶剂中分配平衡时的比例 分配系数：1 64 0 0 流动相 8 32 16 16 16 32 8 16 0 16 0 0 8 32 16 8 固定相 分配系数：3 流动相 固定相

13. 操作过程图示

14. 四、液相色谱分析法的原理 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。 所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。

15. 五、高效液相色谱法的主要类型及原理 1、液-液分配色谱 2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱 4、离子对色谱 5、离子色谱 6、排阻色谱 7、亲和色谱(AC)

16. 1、液-液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。

17. 2、液-固吸附色谱 基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附，常引起峰的拖尾

18. 举例： 苯乙胺类药物中重酒石酸去甲肾上腺素注射液的高效液相色谱测定法。 色谱条件与系统适应性试验：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.14%更烷基磺酸钠溶液——甲醇(65:35)，用磷酸调节PH值至3.0作为流动相；流速为每分钟1ml；检测波长为280nm。理论板数按重酒石酸去甲肾上腺素峰值计算应不低于3000。

19. 反相高效液相色谱法 即指流动相的极性大于固定相极性的色谱方法。在本法中常采用化学键合相作为固定相，流动相采用水——甲醇或水——乙腈系统，在反相色谱中，极性强的组分在分离时先流出柱子，极性弱的组分后流出。因此适合于共存组分极性差异较大的样品分析。如高效液相色谱测定硫酸阿托品片的含量。

20. 举例：巴比妥类药物 苯巴比妥、苯妥英和卡马西平均为临床上常用的抗癫痫药，其药物浓度与疗效和毒副反应密切相关。临床上常将三种药物同时使用，为提高疗效，减少毒副作用与个体差异，为超剂量中毒诊断、治疗与及时调整给药方案提供科学依据，临床上要进行血药浓度检测，而高效液相色谱法是最常用的方法之一。

21. 乙腈(jīng)又名甲基氰，分子式CH3CN，无色透明液体，密度小于水，约为0.79，能与水、乙醇等有机溶剂以任意比混溶，易燃，有毒性。乙腈(jīng)又名甲基氰，分子式CH3CN，无色透明液体，密度小于水，约为0.79，能与水、乙醇等有机溶剂以任意比混溶，易燃，有毒性。

22. 3、离子交换色谱 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换树脂（固定相）之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH- 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ； 阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液； 应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。

23. 4、离子对色谱 基本原理：离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，控制溶质离子的保留行为使其两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X- 进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。

24. 举例：维生素类药物的分析 维生素具有脂溶性和水溶性两大类，由于其化学结构和性质相差较大，在含水介质中，又要受到光、空气、温度和pH的影响，使测定结果不理想。因而，提出用甲醇和水都能溶解的樟脑磺酸，作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠0.125g/ml作为抗氧化剂，能使被测样品处于稳定的初始状态，结果更为可靠。

25. 反相离子对色谱 是分离有机离子的有效方法，离子对试剂和其他添加剂的选用规则：1.样品中含有—COOH,—SO3H基团时，选用的离子对试剂应是带正电荷的有机铵盐，以增加样品阴离子在反响色偶中的保留值，选用的流动相一般是甲醇/水；2.除了加入离子对试剂，还要加入磷酸盐或者其他缓冲液，以控制流动相的酸度；3.样品中含有—NH2和—NH基团或其他阳离子时，选用的离子对试剂应是烷基磺酸盐或硫酸盐；4.样品同时含有—NH2，—COOH,—SO3H等不同性质的基团时则以上规则选用的离子对试剂和添加剂都合理。

26. 举例：芳酸及其酯类药物分析 合成氨基水杨酸钠时，以间氨基酚为原料的生产路线较为普遍，因此在成品中可能含有未完全反应的间氨基酚。USP(24)采用离子对高效液相色谱法检测间氨基酚的限量。 色谱条件：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶(C18,10um)；色谱柱为250mmX46mm；流动相为磷酸二氢钠液(0.05mol/L)—磷酸氢二钠液(0.05mol/L)—甲醇(含氢氧化四丁基铵1.9g)(425:425:100)；检测波长为254nm；流速为1.5ml/min。

27. 5、离子色谱 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。 为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。

28. 阳离子交换：R—H + Na+OH-＝ R—Na + H2O R—H + Na+Br-＝ R—Na + H+Br- 阴离子交换：R—OH + Na+Br- ＝ R—Br + Na+OH- 使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。 若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。

29. 离子色谱连续抑制装置图 双柱型离子色谱装置图

30. 6、空间排阻色谱 原理：又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；可对相对分子质量在103-105范围内的化合物按质量分离

31. 7、亲和色谱(AC) 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)。 这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱

32. 8、薄层层析色谱 是色谱法的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固—液吸附色谱，它集柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于少量样品(几微克，甚至0.01微克)的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此又可用来精制样品。此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板(如玻璃板、塑料片、金属板等)上，形成薄层(常用厚度为0.25毫米左右)后，在此薄层上进行层析分离的方法。 此法在杂环类药物的鉴别实验中有广泛应用。

33. 流动相选择该注意的几点问题 1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微量杂质长期积聚而损坏色谱柱； 2、避免流动相与固定相发生相互作用而使柱效下降或损坏柱子； 3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积； 4、流动相同时还应满足检测器的需求。

34. 液相色谱分离类型参考表 不离解 反相液液色谱 溶于水 水为流动相 同系物 分配色谱 相对分子量 不溶于水 排阻色谱 异构体 吸附色谱 阴离子交换色谱 >2000 不溶于水 非水流动相 溶于水 相对分子量 阳离子交换色谱 具 有 <2000 可离解 亲和色谱 离子对色谱 亲和性 离子色谱 样品 小结：分离类型选择

35. 六、高效液相色谱分析法的应用 由于高效液相色谱具有高速、高效、高灵敏度等特点，近年来，国内外许多专家学者将高效液相色谱技术应用于天然产物（主要是中药）、 农药和食品等行业中， 取得了明显的效果。 下面从实例出发，分析高效液相色谱分析方法在一些方面的应用：

36. 1、高效制备液相色谱在天然产物分离中的 应用 天然产物（主要是中药）种类繁多,所含化学成分种类丰富,且有不少结构相似而含量高低不一, 采用常规方法难以进行分离、 精制。而 HLPC的高灵敏性和高效性使其能有效地分离纯化某些天然产物中的有效成分。如表2列出的便是其中几种。 已有文献对利用HLPC分离一些天然产物进行了报道，如黄酮类化合物（如下表所示）、苷类化合物、有机酸类化合物和生物碱类化合物等等。

38. 2、液相色谱技术在农药残留检测中的应用 液相色谱法是一种经典的分析方法 由于其具有操作简便分析速度快分离效能高 灵敏度高以及应用范围广等特点 目前农药残留物检测70% 采用液相色谱法来进行使用液相色谱法 多种农药可以一次进样 得到完全的分离定性和定量 再配置高性能的检测器 使分析速度更快结果更可靠。 在王志强、钱允辉、张琰论文中，试验测定稻米中吡虫啉农药残留，样品经高速匀浆提取、florisil柱净化 ， 在 269nm波长下，采用高效液相色谱( HPLC) 法分 离测定。结果表明， 吡虫啉回收率为81.90％~87.80％相对标准偏差在3.24%~4.51%，方法最低检出限为0.0016mg/kg， 该方法的准确性、精确性以及灵敏度均达到农药残留分析的要求。

39. 3、高效液相色谱在食品行业中的应用 高效液相色谱法在食品化学分析方面的应用已较为普及，林春晓等用 HPLC对保健食品中的雌二醇分离测定。 王美丽、陈海婷等建立了利用HPLC检测肉制食品中5种邻苯二甲酸酯类增塑剂(PAEs)含量的方法。样品用正己烷提取，C18柱分离，柱温35℃，乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速1.0 ml/min，紫外检测波长226 nm。5种PAEs分离特异性好，在0.02~10微克/毫升之间均具有较好的线性关系，检出限在4.4~13.8ng/mL之间，高、中、低3水平的回收率均在79.5%~102.0%之间，相对标准偏差均在1.1%~14%之间。该方法适用于肉制食品中邻苯二甲酸酯类的检测。

40. 高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量 三聚氰胺 (melamine) 是一种重要的氮杂环有机化工原料 ，为白色或无色结晶 , 通常用于塑料制品中合成树脂的生产。近年来，一些不法厂商将三聚氰胺添加到奶粉中，以增加蛋白质含量。2008年 9月 , 震惊中外的“三鹿婴幼儿奶粉事件 ”暴露出乳制品行业的 “ 潜规则 ”，国内一些知名乳品品牌也被检出其产品中含三聚氰胺。因此 ，如何快速、准确分析乳制品中的三聚氰胺成为多方关关注的问题。 胡阳、倪挥等的论文报道了利用高效液相色谱分析方法测定三聚氰胺的含量。（具体实验步骤见论文）

41. 八、分离数据的处理方法 内标法是色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。内标法是将一定重量的纯物质作为内标物，加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，按公式即可求出被测组分在样品中的百分含量： 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。

42. 用含对照品和内标物的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校正因子 f= (As/ms)/(Ar/mr) 　　其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别为加入内标物和对照品的量。 　　再取各品种项下含有内标物的待测组分溶液进样，记录色谱图，再根据含内标物的待测组分溶液色谱峰响应值，计算含量 mi=f×Ai/(As/ms) 　　其中 Ai和As分别为供试品和内标物的峰面积或峰高，ms为加入内标物的量。必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成为标示量的百分含量，或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量。

43. 注意事项 采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。

44. 外标法适用于工厂中的常规分析。这个方法的精确度，在很大程度上取决于操作条件的控制。样品分析的操作条件，必须严格控制于绘制校正曲线时的条件。当峰高对操作条件的敏感性以及对拖尾峰、柱子超负荷和检测器有大的响应时，给出非线性的校正曲线，此时峰面积计算常常可以得到更好的结果。不过，对重叠峰，难以准确的测量峰面积，必须提高分离度才能达到预期的效果。 对于工厂的常规分析，使用外标法必须经常对校正曲线进行验证。

45. 峰宽 在色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离。它可有三种单位：一是记录纸的距离(mm或cm)，二是时间(min或s)，三是体积(ml)。 出峰时间 主要是和组分的沸点有关，沸点越高出峰时间越晚。如果用极性柱分离时还与组分的极性有关。另外与色谱仪的柱前压或柱流量有关，柱前压或柱流量越大，出峰时间越早。与组分的浓度关系不是太大，当组分浓度较大时，开始出峰的时间相同，但由于浓度较大，流出时间较长，峰的最高点会稍往后移，即组分的浓度增大，出峰时间会稍向后移。

46. 七、参考文献 [1] 何华.生物药物分析.北京：化学工业出版社，2003. [2] 胡阳，倪辉等.高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量.集美大学学报 (自然科学版 ).2010:26-38 [3]周如梅.高效液相色谱及其应用.企 业 技 术 开 发.2005:36-37,45 [4]陈鸳谊，李行诺等.高效制备液相色谱在天然产物分离中的应用.药学进展.2010:337-343 [5]王志强，钱允辉，张琰.稻米中吡虫啉农药残留分析方法.安徽农业科学. 2010,38(5):2216-2217 [6]王美丽，陈海婷等.高效液相色谱测定肉制食品中五种邻苯二甲酸酯.分析实验室.2009:49-52