Κατερίνα  Αναστασίου -Γιώργος Παπαδόπουλος
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 125

Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές PowerPoint PPT Presentation


  • 79 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Κατερίνα Αναστασίου -Γιώργος Παπαδόπουλος Ειδικευόμενοι βιοπαθολ o γίας Γ.Ν.Θ. «Άγιος Παύλος» Συντονίστρια : Αναστασία Βακαλούδη. Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές. Βασική αρχή ανοσολογικών αντιδράσεων. Σύνδεση αντιγόνου- αντισώματος

Download Presentation

Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


2068811

Κατερίνα Αναστασίου -Γιώργος Παπαδόπουλος

Ειδικευόμενοι βιοπαθολoγίας Γ.Ν.Θ. «Άγιος Παύλος»

Συντονίστρια: Αναστασία Βακαλούδη

Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτωνΑρχές μεθόδων-Εφαρμογές


2068811

Βασική αρχή ανοσολογικών αντιδράσεων

Σύνδεση αντιγόνου-αντισώματος

Διάγνωση ευρέως φάσματος νοσημάτων:

Λοιμωδών

Αιμολυτικών

Αυτοάνοσων

Νεοπλασματικών

Ανοσοανεπαρκειών

Διαπίστωση

ιστοσυμβατότητας κ.τ.λ.

Ορατή Μη ορατή


2068811

Ανοσολογικές μέθοδοιΠεριεχόμενα

  • Κύριες μέθοδοι στην εργαστηριακή διερεύνηση των αυτοάνοσων νοσημάτων

  • Aνοσοδιάχυση

  • Συγκόλληση

  • Ηλεκτροφόρηση

  • Θολωσιμετρία

  • Νεφελομετρία

  • Χρωματογραφία

  • Δεσμευτικές ανοσομέθοδοι

    -Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι (RIA-ΙRMA)

    -Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (EIA-ELISA)

    -Χημειοφωταύγεια (CHIA)

    -Ανοσοφθορισμός (ΙFA)

  • Μέθοδοι προσδιορισμού HLA

  • Κυτταρομετρία ροής


2068811

Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης

  • Αρχή μεθόδου

  • Σχέση συγκέντρωσης Ag και Abμε το σχηματισθέν ίζημα

Ag+Ab

Ημίρρευστο υλικό

↑Ab

↑ Ag

Γραμμή καθίζησης

Χρωστική

Σχηματισθέν ίζημα

Πιο εμφανής γραμμή καθίζησης

Ποσοτικές-Ποιοτικές

Συγκέντρωση Ag


2068811

Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης

  • Ποσοτικές

  • Ποιοτικές

  • Διπλή ανοσοδιάχυση

  • (πηκτή)

  • Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση

  • (πηκτή)

  • Μονή ανοσοδιάχυση

  • (υγρό μέσο ή πηκτή)

  • Ηλετροανο-σομέτρηση

  • (πηκτή)


2068811

Ποιοτικές Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης

  • Διπλή διάχυση προς δύο κατευθύνσεις (Ouchterlony)

Γραμμή

καθίζησης

Άγαρ

Διάλυμα

αντισώματος

Διάλυμα

αντιγόνου


2068811

Ποσοτικές Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης

  • Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (Mancini)

Εξεταζόμενος ορός

Άγαρ με ενσωματωμένο αντι-IgG,A,M

αντίσωμα (αντιορό)

(1,2,3,4) ορός γνωστής συγκέντρωσης IgG,A,M

Διάμετρος

δακτυλίου

Συγκέντρωση

αντιγόνου (IgG,A,M)

Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση σε πλάκα


2068811

Μέθοδοι ανοσοδιάχυσηςΕφαρμογές

Προσδιορισμός:

  • CRP

  • Ανοσοσφαιρινών

  • αντι-ΕΝΑ

  • Παραγόντων του συμπληρώματος

  • Διάφορων πρωτεϊνών πλάσματος διαγνωστικής σημασίας κ.α.


2068811

Μέθοδοι συγκόλλησης

Σωματιδιακό αντιγόνο + ομόλογο αντίσωμα → κροκίδες (συγκόλληση)

  • Άμεσες

  • Έμμεσεςή παθητικές

Προσροφημένο αντιγόνο

Φυσικό επιφανειακό αντιγόνο

Κύτταρο ή Σωματίδιο Latex

Κύτταρο

  • Εφαρμογές:

  • Ερυθρά αιμοσφαίρια → Παθητική αιμοσυγκόλληση

  • Σωματίδια Latex → Συγκόλληση Latex


2068811

Ερμηνεία συγκολλητινοαντίδρασης

  • Σχηματισμός δικτυωτού πλέγματος

Αντιγονικές

καθοριστικές ομάδες

Fcτμήμα Ab

Fabτμήμα Ab

Fcτμήμα Ab

Fabτμήμα Ab

Προϋποθέσεις: Ικανή ισχύ Ab, σωστή αναλογία Ag/Ab, παρουσία ηλεκτρολύτη, κατάλληλη θερμοκρασία.


2068811

Μέθοδοι συγκόλλησης

  • Έμμεση αιμοσυγκόλληση

Ερυθρά με προσροφημένο Ag

+

Αb

Συγκόλληση ερυθρών

Rose-Waaler test


2068811

Μέθοδοι συγκόλλησης

  • Συγκόλληση Latex

  • Μέθοδος έμμεσης (παθητικής) συγκόλλησης

  • Σωματίδιο Latex: Σωματίδιο πολυστυρενίου πάνω στο οποίο έχουν προσροφηθεί μόρια αντιγόνου

  • Σχηματική απεικόνιση συγκόλλησης Latex

Σωματίδια

Latex

Ag

Latex με

αντιγόνο

Latex με

αντιγόνο

Συγκόλληση

Latex

Αb


2068811

Μέθοδοι συγκόλλησης

  • Άμεση Coombs

Ερυθρά με προσκολλημένα IgGαντισώματα

Αντι-IgG

(αντι- ανθρώπινη γ-σφαιρίνη)

Συγκόλληση


2068811

Μέθοδοι συγκόλλησης

  • Έμμεση Coombs

1ο Στάδιο

2ο Στάδιο

+

+

Φυσιολογικά

ερυθρά

Ορός αίματος με IgGAb

Προσκόλληση IgGστα ερυθρά

Αντι-IgG

(αντι-ανθρώπινη γ-σφαιρίνη)

Συγκόλληση


2068811

Μέθοδοι συγκόλλησηςΠλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα-Εφαρμογές

  • Πλεονεκτήματα

    Απλότητα, ευκολία, ταχύτητα, μικρό κόστος, μεγάλη ευαισθησία και ποικιλία αντισωμάτων προς ανίχνευση.

  • Μειονεκτήματα

    Μη ειδικές συγκολλήσεις, δυσκολίες στην ανεύρεση και συντήρηση ερυθρών αιμοσφαιρίων, φαινόμενο προζώνης.

  • Γίνονται σε πλάκα ή δοκιμαστικά σωληνάρια και είναι ποιοτικές ή ημιποσοτικές (τίτλος Ab).

  • Εφαρμογές

  • Ποιοτικό και ημιποσοτικό προσδιορισμό CRP, RF, anti-DNA , αντισώματα κατά φωσφολιπιδίων (αLP) κ.α.

  • Διάγνωση της αυτοάνοσης αιμολυτικής αναιμίας.


2068811

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης

  • Φυσικοχημική μέθοδος διαχωρισμού πρωτεϊνών

  • Αρχή μεθόδου

  • Διαχωρισμός πρωτεϊνών με βάση τη διαφορετική (λόγω ΜΒ και φορτίου) κινητικότητα των μορίων εντός κατάλληλου υλικού, κατά την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου

  • Υπεργαμμασφαιριναιμία

  • Οξείες, χρόνιες λοιμώξεις

  • Χρόνιες φλεγμονώδης παθήσεις

  • Νεοπλάσματα

  • Αυτοάνοσα νοσήματα


2068811

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης

  • Ηλεκτροφόρηση ζώνης

  • Ηλεκτροφόρηση εντός αγαρόζης ή οξικής κυτταρίνης

  • PAGE (polycrilamide gel electroforesis)

  • Ηλεκτροφόρηση σε gel πολυακρυλαμιδίου (μοριακό διαχωριστικό μέσο) → αύξηση διαχωριστικής ικανότητας


2068811

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης

  • SDS (sulfododegylic sodium)

  • ΔωδεκυλικόNa→ εκδίπλωση πρωτεϊνών, σταθερή αναλογία φορτίου/μάζας→ κίνηση μορίων αντιστρόφως ανάλογη του ΜΒ

  • SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση

  • Συνδυασμός SDS και PAGE ηλεκτροφόρησης


2068811

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοηλεκτροφόρηση

  • Αρχή μεθόδου

Ορός

Αγαρόζη

Ηλεκτροφόρηση

Διαχωρισμός πρωτεϊνών ορού

Διαδρομή ορού

Αυλάκι

Αντίσωμα (Αντιορός)

Επώαση

Ηλεκτροφόρηση

+

Διπλή ανοσοδιάχυση

Διάχυση αντοορού

Διάχυση πρωτεΐνης

Τόξο καθίζησης


2068811

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοηλεκτροφόρηση

  • Ανοσοηλεκτροφορήματα

Τόξο καθίζησης φυσιολογικής πρωτεΐνης

Τόξο καθίζησης μονοκλωνικής πρωτεΐνης (ανώμαλη πάχυνση ή κύρτωση)

Ανίχνευση μονοκλωνικής

πρωτεΐνης


2068811

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοκαθήλωση

  • Αρχή μεθόδου

Ηλεκτροφόρηση του προς μελέτη ορού

Ανοσοκαθήλωση

φυσιολογικού ορού

Επίστρωση αντιορού σ’ όλη την επιφάνεια ηλεκτροφόρησης

Επώαση

Χρωστική

Ανίχνευση μονοκλωνικής

πρωτεΐνης

Δημιουργία ζώνης καθίζησης


2068811

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοκαθήλωση

  • Εφαρμογές

  • Κρυοσφαιρίνες

  • ds DNA

  • Μονοκλωνικέςανοσοσφαιρίνες (ΡΑ, ΣΕΛ, σύνδρομο Sjögren) κ.α

Ανίχνευση μονοκλωνικής

πρωτεΐνης


2068811

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης

  • Μιας διάστασης διπλή ηλεκτροανοσοδιάχυση

    (counter ηλεκτροφόρηση)

  • Μιας διάστασης μονή ηλεκτροανοσοδιάχυση

    (rocket ηλεκτροφόρηση,τεχνική Laurell)

  • Ανοσοαποτύπωση

    (Western blotting)


Western blot

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοαποτύπωση (Western blot)

  • Αρχή μεθόδου

    Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός βάσει ΜΒ σε πήκτωμαπολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση)

  • Μεταφορά σε ΝΚ με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου

  • Επώαση με Αb

  • Επώαση με αντι-Αbιχνηθετημένο

  • Ακολουθεί ανίχνευση

  • Ενζυμοανοσολογικά

  • Ραδιοϊσοτοπικά

  • Με χημειοφωταύγεια


Western blot1

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοαποτύπωση (Western blot)

  • Εφαρμογές

  • ENA (Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl70, Jo1,CENP κ.α.), dsDNA, AMA, αντι- CCP, κ.α.

  • Ιστόνες (Η1, Η2Α, Η2Β, Η3, Η4) κ.α.

  • Προσδιορισμός κρυοσφαιρινών

  • Πολυπεπτίδια σύνθετων Ag

    (Β΄,Β, D τουSm), (70kD, A, C του RNP)

  • Πολλά ταυτόχρονα Aabsκαι

    πολυπεπτίδια κ.α


2068811

Θολωσιμετρία

  • Μέτρηση της απορρόφησης της ακτινοβολίας, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)


2068811

Νεφελομετρία

  • Μέτρηση της έντασης της σκέδασης, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)


2068811

Νεφελομετρία

  • Πλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα

  • Ακριβής,ταχεία, εύκολη

  • Καλή ευαισθησία και ειδικότητα

  • Δυνατότητα μέτρησης χαμηλών συγκεντρώσεων (10ˉ³ - 10ˉ⁶g/L)

  • Αυτοματοποιημένη

  • Σφάλματα μετρήσεων (λιπαιμικός ορός, σκόνη, συγκρίματα πρωτεΐνών).

  • Εφαρμογές

  • ΑνοσοσφαιρίνεςIgG,IgM, IgA, IgE

  • Υποτάξεις ανοσοσφαιρινών

  • κ και λ αλυσίδες

  • C3, C4, CRP, RF

  • β2 μικροσφαιρίνη

Ένταση σκεδ/νου φωτός

Συγκέντρωση πρωτεϊνών


2068811

Χρωματογραφία

  • Ομάδα μεθόδων για το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος, που μοιάζουν μεταξύ τους ως προς τις φυσικές και χημικές ιδιότητες, π.χ. πρωτεΐνες, αμινοξέα, σάκχαρα, βιταμίνες, φάρμακα.

  • Μίγματα όπως

    • Βιολογικά υγρά

    • Πλάσμα

    • Ούρα

    • Εκχύλισμα ιστών


2068811

Χρωματογραφία

  • Αρχή μεθόδου

  • Είναι σύστημα ΔΥΟ ΦΑΣΕΩΝ: σταθερής και κινητής.

  • Το δείγμα διοχετεύεται στην κινητή φάση ή εφαρμόζεται στη σταθερή

  • Η κινητή φάση ρέει κατά μήκος της σταθερής και παρασύρει το δείγμα

  • Ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος στηρίζεται στο διαφορετικό βαθμό αντίδρασής τους με καθεμιά από τις φάσεις.


2068811

Χρωματογραφία

  • Χρωματογραφικές μέθοδοι

  • Πηκτής

  • Ανταλλαγής ιόντων

  • Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC)

  • Συγγενείας

  • Εφαρμογές

  • CRP

  • ENA

  • Ανοσοσυμπλέγματα κ.α.

HPLC


2068811

Δεσμευτικές ανοσομέθοδοι

  • Μέθοδοι ΙΑ

  • RIA-IRMA

  • ΕΙΑ (ELISA) (10ˉ⁹ - 10ˉ¹² g/L)

  • CHIA-ΙCHIA

  • IFA

    Ανταγωνιστικές

    Μη ανταγωνιστικές

    Ποιοτικές-Ποσοτικές

  • Αρχή μεθόδου


Competitive immunoassay

Ανταγωνιστικές ανοσομέθοδοι (Competitive immunoassay)

  • Αρχή μεθόδου

    Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας

  • Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής μεθόδου


Mmunometric assay

Μη ανταγωνιστικές ανοσομέθοδοι (Ιmmunometric assay)

  • Αρχή μεθόδου

    Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας

  • Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής μεθόδου


Radio immuno assay ria

Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι Radio-Immuno-Assay (RIA)

  • Αρχή μεθόδου

    Ανταγωνιστική τεχνική στην οποία χρησιμοποιούμε ραδιενεργά σημασμένοAg το οποίο ανταγωνίζεται με το προς μέτρηση Ag για την πρόσδεση σε περιορισμένη ποσότητα του αντίστοιχου Ab


Immuno radio metric assay irma

Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι Immuno-Radio-Metric-Assay (IRMA)

  • Αρχή μεθόδου

  • H προς μέτρηση ουσία δεσμεύεται από δύο Ab, ένα ραδιενεργό και ένα μη ραδιενεργό

  • Περισσότερο ευαίσθητη

  • Σχηματική απεικόνιση ΙRMA


2068811

Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοιΕφαρμογές

  • Εφαρμογές

  • CRP, RF

  • Συμπλήρωμα

  • dsDNA, AMA, Αbsκατά φωσφολιπιδίων (aLP) κ.α.

  • Αντιθυρεοσφαιρινικά αντισώματα (anti-TG).

  • Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικήςυπεροξειδάσης (anti-TPO).

  • Αντιμικροσωμιακάθυροειδούς (anti-M).


Enzyme links immuno sorment assay elisa

Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ΕΙΑ)Enzyme-Links-Immuno-Sorment-assay (ELISA)

  • Αρχή μεθόδου

    Ανίχνευση της προσδιοριζόμενης ουσίας με τη χρήση δεύτερης, ομοιοπολικά συνδεδεμένης με ένζυμο, που έχει σχέση Ag/Ab

Χρωμογόνο υπόστρωμα

(άχρωμο)

Ένζυμο

Προϊόν έγχρωμο

Φωτόμετρο

Οπτική πυκνότητα έγχρωμου προϊόντος

Βαθμονομημένη καμπύλη

Συγκέντρωση προσδιοριζόμενης ουσίας


Elisa

Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ΕΙΑ) ELISA

  • Ανταγωνιστική ΕLISA

  • Η τελική χρωματική ένταση αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας

  • Μέθοδος εκλογής για μικρού ΜΒ ουσίες

  • Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής ELISA


Elisa1

Ανοσοενζυμικές μέθοδοι ELISA

  • Μη ανταγωνιστική (μέθοδος Sandwich)

    Η τελική χρωματική ένταση ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας

  • Μέθοδος εκλογής για

    ειδικά Ab, αυτοαντισώματα,

    κυτταροκίνες, ελεύθερ0υς υποδοχείς κ.α.

  • Πιο ευαίσθητη, λιγότερο

    ειδική από την ανταγωνιστική

  • Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής ELISA


2068811

Εφαρμογές ΕLISA

  • Αυτοαντισώματα

  • ΑΝΑ

  • anti-DNA

  • Anti-ENA

  • AMA

  • ASMA

  • p-ANCA, c-ANCA

  • anti-GB

  • anti-TG, anti-TPO

  • RF

  • Αντι-CCP

  • Καρδιολιπίνης, φωσφολιπιδίων κ.α.

  • Κυτταροκίνες και διαλυτοί υποδοχείς κυτταροκινών

  • Παράγοντες συμπληρώματος

  • Ειδικά Ab, τάξης ΙgE, (μέθοδος RAST)

  • Μόρια προσκόλλησης, αυξητικοί παράγοντες, προσταγλανδίνες, λευκοτριένια, κυτταροτοξικά αντισώματα κ.α.


Elisa vs ria

ELISA vs RIA

USERIA(x1000 ευαισθησία)


Chemiluminescence immuno assay chia

Χημειοφωταυγιομετρικές μέθοδοι Chemiluminescence-Immuno-Assay (CHIA)

  • Αρχή μεθόδου

    Αντί χρωμογόνων και, φθοριζόντων υποστρωμάτων χρησιμοποιούνται υποστρώματα τα οποία φωταυγάζουν, δηλαδή έχουν την ιδιότητα να μετατρέπουν μέρος της ενέργειας, από μία μεσολαβούσα χημική αντίδραση, σε φωτεινή ακτινοβολία

  • Αλκαλική φωσφατάση

  • Αποφοσφορυλίωση

    υποστρώματος → ασταθές

    προϊόν που φωταυγάζει


2068811

Εφαρμογές Χημειοφωταύγειας

  • Αντισώματα έναντι εκχυλίσματος πυρηνικών αντιγόνων (anti-ENA).

  • Αντισώματα έναντι της διπλής έλικας DNA (anti-dsDNA).

  • Αντικαρδιολιπινικά αντισώματα (αCL-IgG, IgM).

  • Αντι-β2 γλυκοπρωτ/εϊνικάαντισ/τα (αβ2GPI-IgM, IgG).

  • Αντιγλοιαδινικά αντισώματα (DGP-IgG, IgA).

  • Αντισώματα τρανσγλουταμινάσης (anti-tTG-IgA).

  • Αντιθυρεοσφαιρινικά αντισώματα (anti-TG).

  • Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικήςυπεροξειδάσης(anti-TPO) κ.α.


Chia vs elisa ria

CHIAVS ELISA - RIA

  • Μεγάλη ευαισθησία

  • Μικρό όγκο δείγματος

  • Μικρό χρόνο επώασης

  • Σταθερά αντιδραστήρια

  • Πλήρως αυτοματοποιημένη μέθοδος

  • Μετράει φως και ευκολότερα δέχεται παρεμβολές από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός).


Immuno fluorescence assay ifa

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Αρχή μεθόδου

    Ανοσοϊστοχημική τεχνική κατά την οποία το ειδικό σύμπλεγμα Ag-Ab γίνεται ορατό με τη βοήθεια Abσημασμένου με φθοριόχρωμαστο μικροσκόπιο φθορισμού


Immuno fluorescence assay ifa1

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Φθορίζον αντίσωμα

    Αντιορός έναντι της ανθρωπείου γ-σφαιρίνης ή μεμονωμένων τάξεων ανοσοσφαιρινών, σημασμένων με φθορίζουσα χρωστική


Immuno fluorescence assay ifa2

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Αρχή παραγωγής φθοριοχρώματος

  • Φθορισμός

    Εκπομπή φωτός μεγαλύτερου μήκους κύματος από μια ουσία όταν αυτή ακτινοβοληθεί με φως μικρότερου μήκους κύματος.

  • Φθοριοχρώματα

  • Ισοθειακυανικήφλουορεσκίνη (FITC)-πράσινη

  • Ισοθειοκυανικήτετραμεθυλροδαμίνη (TMRITC)-κόκκινο

  • Φυκοερυθρίνη (PE)-πορτοκαλί


Immuno fluorescence assay ifa3

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Μικροσκόπιο με

    προσπίπτοντα

    φωτισμό

Προσοφθάλμιος

Ηθμός φραγμού

Δίκοιλοκάτοπτρο

αντικειμενικός

Διεγερτικός ηθμός

παρασκεύασμα


Immuno fluorescence assay ifa4

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Μικροσκόπιο με

    διερχόμενο φωτισμό

Προσοφθάλμιος φακός

αντικειμενικός

Ηθμός φραγμού

πυκνωτής

παρασκεύασμα

Διεγερτικός ηθμός


2068811

Μικροσκόπιο φθορισμού


Immuno fluorescence assay ifa5

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Άμεση μέθοδος

  • Έμμεση μέθοδος

  • Αρχή λειτουργίας ανοσοφθορισμού

Αντι-IgAbσημασμένο

Με φθοριό-

χρωμα

Άμεσος IFA

Έμμεσος IFA


Immuno fluorescence assay ifa6

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Χρώση του συμπληρώματος

  • Αρχή λειτουργίας χρώσης του συμπληρώματος

Συμπλήρωμα

Υπόστρωμα

(Ag)

Μη σεσημασμένο Ab

+

Συμπλήρωμα

+

Σεσημασμένο Abέναντι του συμπληρώματος

Αντι- C3 Ab

Φθορίζον σύμπλεγμα


Immuno fluorescence assay ifa7

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Διπλή φθορίζουσα χρώση

Δύο αντιοροί + Δύο φθοριοχρώματα

Δύο ανοσοσυμπλέγματαAg-Ab

Δύο χρώματα στη

μικροσκόπηση


Immuno fluorescence assay ifa8

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Τεχνική της μεθόδου


Immuno fluorescence assay ifa9

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Πλεονεκτήματα

  • Καλή ειδικότητα, ευαισθησία

  • Ευκολία στην εκτέλεση

  • Χαμηλό κόστος

  • Προσδιορισμός της τάξης του αντισώματος που αντιδρά

  • Προσδιορίζεται το αντιγόνο στο σημείο που υπάρχει

  • Μειονεκτήματα

  • Εξειδικευμένο προσωπικό (μικροσκόπηση)

  • Υποκειμενική εκτίμηση του αποτελέσματος

  • Ημιποσοτικός προσδιορισμός

  • Χρονοβόρα τεχνική διαδικασία

  • Ανιχνεύει Ag σε κύτταρα ή μεγάλα μόρια και όχι διαλυτά Ag


2068811

IFA-Σωστή έκφραση του αποτελέσματος και προτυποποίηση της δοκιμασίας

  • Αποτέλεσμα

  • Ο τίτλος του ορού, δηλαδή η μεγαλύτερη αραίωση που δίνει θετικό αποτέλεσμα.

  • Το πρόβλημα….

  • Επαναληψιμότητα

  • Σύγκριση αποτελεσμάτων από εργαστήριο σε εργαστήριο

    -Ποικιλία υποστρωμάτων

    -Διαφορετικοί αντιοροί

    -Διαφορετικά μικροσκόπια

    -Διαφορετική απόδοση του μικροσκοπίου.

  • Η λύση

  • Πρότυπος ορός WHO (66/233-100 IU/ml όριο θετικότητας 6 IU/ml)

  • Οπτικές πρότυπες αντικειμενοφόρες πλάκες.


Immuno fluorescence assay ifa10

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

  • Εφαρμογές

  • Ανίχνευση αυτοαντισωμάτων

    (ANA-screening, αντι-dsDNA, ANCA, AMA, ASMA, οργανοειδικάAb)

  • Ανίχνευση ανοσοσφαιρινών και συμπληρώματος (ιστούς)

  • Αντιγόνα λεμφοκυττάρων, μακροφάγων,κοκκιοκυττά-ρων, ερυθρών αιμοσφαιρίων

  • Συστατικά ομάδων αίματος κ.α.


2068811

Αυτοαντισώματα που ανιχνεύονται με τον έμμεσο ανοσοφθορισμό

  • Μη οργανοειδικάαυτοαντισώματα

  • Έναντι του πυρήνα και της πυρηνικής μεμβράνης (ΑΝΑ)

  • Έναντι του κυτταροπλάσματος (ΑΜΑ, RIBA, LKM, ARA, ASMA, MF, IMF)

  • Ab που συνδέονται με κοιλιοκάκη (AGA, EMA)

  • BCLA , G-cyt, έναντι των χολαγγείων (CBA), έναντι της

    συσκευής Golgi, λυσοσωματίων, κεντριολίων κ.α.


2068811

Αυτοαντισώματα που ανιχνεύονται με τον έμμεσο ανοσοφθορισμό

  • Οργανοειδικάαυτοαντισώματα

  • Αντιθυρεοειδικά (TMA)

  • Αντιεπινεφριδικά (CSA)

  • Αντιπαγρεατικά (ICA)

  • Αντιτοιχωματικά (APCA)

  • Έναντι της διαφανούς ζώνης του ωαρίου, σπερματοζωαρίων, αιμοπεταλίων, ερυθροκυττάρων, υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, μελανοκυττάρων κ.α.


Antinuclear antibody ana

Μη οργανοειδικά αντισώματαΈναντι του πυρήνα (antinuclear Antibody-ANA)

  • Είδη υποστρωμάτων

    Α) Κύτταρα από καλλιέργειες ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων

  • Hep-2

  • Hela

  • KB

    Β) Yποστρώματα οργάνων αρουραίου (ήπαρ-νεφρός-στόμαχος)

    Γ) Μαστιγοφόρο Crithidialuciliae (αντι-ds DNA)

    Αρχική αραίωση του ορού

  • 1/80 για ΑΝΑ

  • 1/20 για anti-DNA

    Σεσημασμένος αντιορός (Conjugate)

  • Πολυδύναμος αντιανθρώπειος ορός κονίκλου συνδεδεμένος με FITC

    Αποτέλεσμα

  • Τίτλος αυτοαντισωμάτων


Antinuclear antibody ana1

Μη οργανοειδικά αντισώματαΈναντι του πυρήνα (antinuclear Antibody-ANA)

  • Μορφή φθορισμού

  • Διάχυτος ή ομοιογενείς (diffuse,homogenous)

  • Στικτός ή κοκκιώδης (coarse,fine-speckled)

  • Περιφερικός ή δακτυλιοειδής (rim,shaggy,peripheral)

  • Μεμβρανώδης (membranous)

  • Διακριτός (Λαμπερός) στικτός (discrete speckled)

  • Πυρηνιδίου (nucleolar)


2068811

ΑΝΑΑρνητικό για φθορισμό

Hep-2, ΑΝΑ negative


2068811

ΑΝΑΔιάχυτος ή ομοιογενής φθορισμός

  • Φθορισμός

  • Αφορά όλο το πυρηνόπλασμα με επίταση σε ορισμένες περιοχές

  • Αντισώματα

  • Έναντι ιστονών και δευτερευόντως έναντι dsDNA, ssDNAκαι συμπλέγματος DNA με ιστόνες.

  • Συσχέτιση με νόσο

  • Όλα τα αυτοάνοσα νοσήματα

Hep-2, homo. nuclear


Dna ds dna

ΑΝΑ- Αντισώματα έναντι της διπλής έλικας του DNA (ds-DNA)

  • Φθορισμός

  • Κινητοπλάστη του Crithidialuciliaeσαν δίσκος ή δακτύλιος εντονότερος του πυρήνα

  • Αντιγόνο

  • ds-DNA

  • Συσχέτιση με νόσο

  • ΣΕΛ

  • Άλλες ρευματοπάθειες (χαμηλός τίτλος)

Crithidia Luciliae

negative

CrithidiaLuciliaeds-DNA positive


Coarse speckled

ΑΝΑ-Στικτός ή κοκκιώδης φθορισμόςαδρός στικτός (coarse-speckled)

  • Φθορισμός

  • Μεγάλα κοκκία σαφώς διακρινόμενα μεταξύ τους

  • Αντισώματα

  • Εκχυλιζόμενα πυρηνικά Ag ENA (SSA, SSB, nRNP,Sm, κ.α.)

  • Συσχέτιση με νόσο

  • ΣΕΛ

  • MCTD

  • Συστηματική σκλήρυνση

  • Sjögren´s Syndrome κ.α.

Hep-2 , coarse speckled


Fine speckled

ΑΝΑ-Στικτός ή κοκκιώδης φθορισμόςλεπτός στικτός (fine-speckled)

  • Φθορισμός

  • Μικρά κοκκία με ασαφή όρια

  • Αντισώματα

  • Εκχυλιζόμενα πυρηνικά Ag ENA (Scl-70, Jo-1)

  • Συσχέτιση με νόσο

  • Σκληρόδερμα

  • Πολυμυοσίτιδα/Δερματο-μυοσίτιδα

  • Αρτηριΐτιδα κ.α.

Hep-2, fine speckled


Ana rim shaggy peripheral

ANA-Περιφερικός ή δακτυλ/δήςφθορισμός (rim,shaggy,peripheral)

  • Φθορισμός

  • Η περιφέρεια του πυρήνα εμφανίζεται σαν παχύς δακτύλιος δίνοντας την εντύπωση RBC.

  • Αντισώματα

  • dsDNA, σύμπλεγμα dsDNA- ιστονών ή πρωτεΐνες πυρηνικής μεμβράνης

  • Συσχέτιση με νόσο

  • ΣΕΛ

  • Άλλες ρευματοπάθειες

    (σε χαμηλό τίτλο)

Ηep-2, perif. nuclear


Membranous

ΑΝΑ-Μεμβρανώδης φθορισμός (membranous)

  • Φθορισμός

  • Λεπτός φθορισμός της πυρηνικής μεμβράνης κυττάρων σε φάση ηρεμίας.

  • Αντισώματα

  • Πεπτίδια που βρίσκονται στις Α, Β, C, πρωτεΐνες της πυρηνικής μεμβράνης (lamins)

  • Συσχέτιση με νόσο

  • Νοσήματα ήπατος (πρωτοπαθή χολική κίρρωση)

  • Σκληρόδερμα κ.α.

Hep-2, mem. nuclear


Discrete speckled

ΑΝΑ-Διακριτός (Λαμπερός) φθορισμός (Discrete speckled)

  • Α) Αντικεντρομεριδιακός

    (centromere specificity)

  • B) Άτυπος λαμπερός ή φθορισμός πολλαπλών κοκκίων / στιγμάτων του πυρήνα

    (atypical discrete speckled -multiple nuclear dots-MND)


2068811

ANA -Διακριτός φθορισμός Α) Φθορισμός κεντρομεριδίου

  • Φθορισμός

  • Φάση ηρεμίας:20-25 μικρά κοκκία διάσπαρτα στον πυρήνα.

  • Πρόφαση: νέφος κοκκίων πάνω στα χρωματοσώματα.

  • Μετάφαση-Ανάφαση: κοκκία με μορφή ραβδίων (bars).

  • Αντισώματα

  • Μη ιστονική πρωτεΐνη στενά συνδεδεμένη με το κεντρομεριδιακό τμήμα του DNA.

  • Συσχέτιση με νόσο

  • Σύνδρομο CREST(49-96%)

  • Raynaud

  • Σκληρόδερμα κ.α.

Hep-2 , cent. nuclear


2068811

ANA -Διακριτός φθορισμός Α) Φθορισμός κεντρομεριδίου

Hep-2 , cent. nuclear


Ana b mnd

ANA-Διακριτός φθορισμός B) Φθορισμός πολλαπλών πυρ. κοκκίων (MND)

  • Φθορισμός

  • 4-20 μικρά ανοσομεγέθη κοκκία. Δεν υπάρχουν σε κύτταρα μίτωσης (δ.δ. από αντικεντρομεριδιακό).

  • Αντισώματα

  • Πρωτεΐνες στα πυρηνικά σωμάτια (nuclear bodies).

  • Συσχέτιση με νόσο

  • Πρωτοπαθή χολική κίρρωση (κυρίως με Secca)

  • Αδιαφοροποίητη κολλαγόνωση (με ή χωρίς πρωτοπαθή χολική κίρρωση).

Hep-2, MND


Ana noucleolar

ANA - Φθορισμός πυρηνιδίου (noucleolar)

  • Φθορισμός

  • 1-4 μεγάλα, χοντρά και ανισομεγέθη κοκκία που δίνουν διάχυτο, στικτό ή περιφερικό φθορισμό σε κύτταρα ηρεμίας.

  • Αντισώματα

  • RNA ή RNA-πολυμεράση Ι των πυρηνίσκων

  • Συσχέτιση με νόσο

  • Σκληρόδερμα

  • Sjogren´s Syndrome

  • ΣΕΛκ.α.

Hep-2, nucl. nuclear

Hep-2, nucl. nuclear


2068811

Ομειογενείς + φθορισμός πυρηνιδίου

Hep-2, homo. nuclear + nucl. nuclear


2068811

Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος

  • Αντιγονικός στόχος

  • Οργανίδια

  • Κυτταροσκελετός

  • Υπόστρωμα

  • Ιστικές τομές οργάνων

  • Hep-2

  • Αρχική αραίωση

  • 1:40

  • Σεσημασμένος αντιορός

  • Πολυδύναμος αντιανθρώπειος ορός κονίκλου συνδεδεμένος με φθοριόχρωμα.


2068811

Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος

  • Αντιμιτοχονδιακά (ΑΜΑ: anti-mitochodrial antibodies)

  • Αντιριβοσωμιακά (RIBA: ribosomal antibodies)

  • Αντιμικροσωμιακά (LKM:Liver kidney microsomal antibodies)

  • Αντισώματα έναντι της ρετικουλίνης (ARA: anti-reticular antibodies)

  • Αντισώματα έναντι των λείων μυϊκών ινών (ASMA: antismooth muscle antibodies)

  • Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF:micro filaments)

  • Αντισώματα έναντι των ενδιάμεσων ινιδίων (IMF:intermedia filaments)


A anti mitochodrial antibodies

A) Αντιμιτοχονδιακά αντισώματα (Anti-Mitochodrial Antibodies-ΑΜΑ)

  • Υπόστρωμα

  • Ήπαρ

  • Νεφρός

  • Στόμαχος αρουραίου.

    Φθορισμός: Λεπτός, κοκκιώδης,κυτταροπλασματικός, όχι καλά οργανωμένος.

  • Hep-2

    Φθορισμός: Λεπτός κοκκιώδης, κυτταροπλασματικός, αποτελούμενος από γραμμοειδής σχηματισμούς (ακτίνες ποδηλάτου).

  • Αντισώματα

  • (Μ1-Μ9)

  • Συσχέτιση με νόσο

  • Μ2: ΠΧΚ (95%)

  • Μ4: Μικτές χολοστατικές ηπατοπάθειες με ή χωρίς ΠΧΚ, χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα (25-30%)

  • ΣΕΛ, ΡΑ.


A anti mitochodrial antibodies1

A) Αντιμιτοχονδιακά αντισώματα (Anti-Mitochodrial Antibodies-ΑΜΑ)

MSK, Mitochondrial

Hep-2, Mitochondrial


2068811

ΑΜΑ + Μεμβρανώδης φθορισμός του πυρήνα

Hep-2 + MSK, mem. Nuclear + mito.


2068811

AMA + Φθορισμός του κεντρομεριδίου

Hep-2, AMA + cent. nuclear


B ribosomal antibodies riba

B) Αντιριβοσωμιακά αντισώματα(RIBosomal Antibodies-RIBA)

  • Υπόστρωμα

  • Ήπαρ

  • Νεφρός

  • Στόμαχος αρουραίου

    Φθορισμός: Λεπτός, κοκκιώδης, πυκνός και αρκετά οργανωμένος.

  • Hep-2

    Φθορισμός:Λιγότερο σαφής, περισσότερο πυκνός από AMA,LKM, δίνει την εντύπωση διάχυτου φθορισμού.

  • Αντισώματα

  • Τρείς υποομάδες της ριβοσωματικής πρωτεΐνης P (P0,P1,P2)

  • Συσχετισμός με νόσους

  • ΣΕΛ (με προσβολή ΚΝΣ, ψύχωση)

  • ΡΑ

  • Χρόνια ενεργό αυτοάνοση ηπατίτιδα.


B ribosomal antibodies riba1

B) Αντιριβοσωμιακά αντισώματα(RIBosomal Antibodies-RIBA)

HEp-2, Ribosomal

MSK, Ribosomal

MSK, Ribosomal, 20x

Hep-2, Mitochondrial


Liver kidney microsomal lkm

Γ) Αντιμικροσωμιακά αντισώματα(Liver Kidney Microsomal-LKM)

  • Υπόστρωμα

  • Ήπαρ

  • Νεφρός

  • Στόμαχος αρσενικού αρουραίου και άλλων ζώων.

    Φθορισμός: νεφρικών σωληναρίων και αγκύλης του Henleστη φλοιώδη μοίρα του νεφρού.

  • Αντισώματα

  • Πρωτεΐνη της έσω επιφάνειας των σωληναρίων του λείου ενδοπλασματικού δικτύου.

  • Συσχετισμός με νόσους

  • LKM1: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα

  • LKM2: Ηπατίτιδα από φάρμακα

  • LKM3: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα.


Liver kidney microsomal lkm1

Γ) Αντιμικροσωμιακά αντισώματα(Liver Kidney Microsomal-LKM)

MSK, LKM Microsomes


Anti reticular antibodies ara

Δ) Αντισώματα ρετικουλίνης(Anti-Reticular Antibodies-ARA)

  • Υπόστρωμα

  • Ήπαρ

  • Νεφρός

  • Στόμαχος αρουραίου

    Φθορισμός: Λεπτές, σπειροειδείς, διακεκομμένες ή συνεχείς φθορίζουσες ίνες.

  • Αντισώματα

  • Γλυκοπρωτεΐνη του συνδετικού ιστού

  • Συσχετισμός με νόσους

  • Rs, R2: Νόσους του συνδετικού ιστού (Crohn, ερπητική δερματίτιδα, σύνδρομο δυσαπορρόφησης), φυσιολογικά άτομα.

  • R1: Κοιλιοκάκη, ερπητική δερματίτιδα, Crohn.


Anti reticular antibodies ara1

Δ) Αντισώματα ρετικουλίνης(Anti-Reticular Antibodies-ARA)

MSK, Reticuline


E anti smooth muscle antibodies asma

E) Αντισώματα έναντι λείων μυϊκών ινών (Anti-Smooth Muscle Antibodies-ASMA)

  • Υπόστρωμα

  • Ήπαρ

  • Νεφρός

  • Στόμαχος αρουραίου

    Φθορισμός: Λείες μυϊκές ίνες αγγείων νεφρού, ήπατος, ενδιάμεσα ινίδια και βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα στομάχου.

  • Αντισώματα

  • Πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού: ακτίνη (SMAT, SMAG), μυοσίνη, τροπομυοσίνη, βιμεντίνη κ.α.(SMA-V).

  • Συσχετισμός με νόσους

  • SMAT-G: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα, Πρωτοπαθή χολική κίρρωση

  • SMA-V: Χρόνιες ηπατοπάθειες, ιογενείς λοιμώξεις, καρκινοπαθείς κ.α.


E anti smooth muscle antibodies asma1

E) Αντισώματα έναντι λείων μυϊκών ινών (Anti-Smooth Muscle Antibodies-ASMA)

MSK, smooth muscle

MSK, smooth muscle


Mf imf

ΣΤ) Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF) και ενδιάμεσων ινιδίων (IMF)

  • Υπόστρωμα

  • Hep-2

    Φθορισμός: Κυτταροπλασματικός με γραμμώσεις επιμήκεις και παράλληλες μεταξύ τους (γρατζουνιά γάτας)-MF.

    Κυτταροπλασματικός αραχνοειδής με κυματοειδής γραμμώσεις εν ίδει δικτύου-IMF.

  • Αντισώματα

  • MF: Ακτίνη

  • IMF: Πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού ( βιμεντίνη, δεσμίνη, κερατίνη κ.α

  • Συσχετισμός με νόσους

  • MF: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα, πρωτοπαθή χολική κίρρωση.

  • IMF: Οξεία και χρόνια ηπατίτιδα, πρωτοπαθή χολική κίρρωση, ΡΑ, ιώσεις κ.α.


Mf imf1

ΣΤ) Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF) και ενδιάμεσων ινιδίων (IMF)

Hep-2, microfilaments

Hep-2, microfilament+intermedia filaments


Antibodies against neutrofil cytoplasmic antigens anca

Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος των ουδετερόφιλων (Antibodies against NeutrofilCytoplasmic Antigens-ANCA)

  • Υπόστρωμα

  • Ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα μονιμοποιημένα με αιθανόλη

    Φθορισμός:

  • cANCA (cytoplasmatic or classical): λεπτός στικτός φθορισμός του κυτταροπλάσματος

  • pANCA (perinuclear): περιπυρηνικός ή και πυρηνικός φθορισμός.

  • Αντισώματα

  • cANCA: Πρωτεϊνάση 3 (PR3)

  • pANCA: Μυελοϋπεροξειδάση (MPO), ελαστάση, λυσοζύμη κ.α.

  • Συσχετισμός με νόσους

  • cANCA: Κοκκιωμάτωση Wegener (75-90%)

  • pANCA:Μικροσκοπική πολυαγγειΐτιδα (50-75%), σύνδρομο Churg-Strauss (40-60%), σπειραματονεφρίτιδα κ.α.


Antibodies against neutrofil cytoplasmic antigens anca1

Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος των ουδετερόφιλων (Antibodies against NeutrofilCytoplasmic Antigens-ANCA)

cANCA

pANCA


Canca ana

cANCA + ANA

cANCA + ANA


M anti parietal cells antibodies apca

Mη οργανοειδικάαυτοαντισώματαΈναντι των τοιχωματικών κυττάρων του στομάχου (Anti Parietal Cells Antibodies-APCA)

  • Υπόστρωμα

  • Στόμαχος ανθρώπου, ποντικού ή αρουραίου.

    Φθορισμός: Κυτταροπλασματικός, πυκνός, των τοιχωματικών κυττάρων των γαστρικών αδένων.

  • Αντισώματα

  • Λιποπρωτεΐνη των μικροσωμάτων.

  • Συσχετισμός με νόσους

  • Κακοήθη αναιμία (90-95%), δ.δ. από άλλες μεγαλοβλαστικές αναιμίες

  • Ατροφική γαστρίτιδα, γαστρικά έλκη

  • Νόσος του θυρεοειδούς

  • Νόσος του Addison

  • Διαβήτη τύπου 1

  • Σιδηροπενική αναιμία

  • Λεύκη

  • Υγιή πληθυσμό- Υπερήλικες (8%)


Anti parietal cells antibodies apca

Μη οργανοειδικάαυτοαντισώματαΈναντι των τοιχωματικών κυττάρων του στομάχου (Anti Parietal Cells Antibodies-APCA)

MSK, parietalcells

MSK, parietal cells


2068811

Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά

  • CRP

  • Μέθοδος συγκόλλησης Latex

  • Απλή ακτινωτή ανοσοδιάχυση

  • Ηλεκτροανοσοδιάχυση

  • Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA)

  • Νεφελομετρία κ.α.

  • RF

  • Μέθοδος συγκόλλησης Latex

  • Ανοσοενζυμική (ELISA)

  • Ραδιοανοσολογική (RIA)

  • Νεφελομετρία κ.α.


2068811

Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά

  • Συμπλήρωμα

  • Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA)

  • Θολωσιμετρία

  • Νεφελομετρία

  • Ανοσοσυμπλέγματα(αδιάλυτα μεγαλομοριακά συμπλέγματα αντιγόνου-αντισώματος που καθιζάνουν στους ιστούς και προκαλούν βλάβες)

  • Χρωματογραφία

  • Ηλεκτροφόρηση

  • Ανοσοενζυμική μέθοδος (ΕLISA) κ.α.


2068811

Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά

  • Κρυοσφαιρίνες

    Ανοσοσφαιρίνες που καθιζάνουν σε χαμηλή θερμοκρασία.

  • Σύνδρομο Sjögren (τύπος ΙΙ)

  • Αυτοάνοσα νοσήματα (τύπος ΙΙΙ)

  • Προσδιορισμός

    Ποσοτικά:

  • Με κρυοκρίτη

    α) V ιζήματ0ς/ V ολικό %

    β) Ολική πρωτείνη ορού προ και μετά την καθίζηση

    Ποιοτικά:

  • Ανοσοηλεκτροφόρηση

  • Ανοσοκαθήλωση

  • Ανοσοαποτύπωση


2068811

Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά


2068811

Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά


2068811

Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά

  • dsDNA (ΣΕΛ)

  • IFA (Crithidialucilliae, ειδική αλλά όχι πολύ ευαίσθητη)

  • RIA υγρής φάσης (μέθοδος αναφοράς)

  • ELISA

  • Ανοσοαποτύπωση

  • Ανοσοκαθήλωση

  • ENA

    Sm (ΣΕΛ)

    nRNB (ΜΝΣΙ)

    SS-A(RO), SS-B (LA) (Sgögren)

    Scl-70 (σκληρόδερμα)

    Jo-I (πολυμυοσίτιδα)

  • IFA (ΑΝΑ θετικά + τύπος φθορισμού)

  • ELISA

  • Χρωματογραφία

  • Ανοσοαποτύπωση


2068811

Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά

  • ANCA

    pANCA

    cANCA (κοκκιωμάτωση Wegener)

  • IFA (περιπυρηνικός ή κυτταροπλασματικός)

  • ΕLISA (anti-MPO ή anti-PR3)

  • AMA(ΠΧΚ)

  • IFA

  • ELISA

  • Ανοσοαποτύπωση

  • RIA


2068811

Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά

  • Abs κατά φωσφολιπιδίων (aPL)

    (αντιφοσφωλιπιδικόσύνδρομο,ΣΕΛ)

  • RIA

  • ELISA

  • Δοκιμασίες πήξεως (αντιπηκτικό του λύκου)

  • Συγκολλητινοαντιδράσεις (VDRL)


2068811

HLA-Συσχέτιση με νοσήματα


2068811

Τυποποίηση HLA

  • Μικρολεμφοκυτταροτοξική μέθοδος

Kύτταρα +

Αντιορούς (αντι-HLA γνωστής ειδικότητας)

Επώαση

Σύμπλεγμα Ag-Ab ??? +

Συμπλήρωμα

Εωσίνη

Θετική αντίδραση

Λύση κυττάρων

(Μεγάλα, σκοτεινά,

μη ακτινοβόλα κύτταρα)

Αρνητική αντίδραση

Μη λύση κυττάρων

(Μικρά, λαμπερά,

ακτινοβόλα κύτταρα)


Hla abc

Έντυπο συμπλήρωσης αποτελέσματος HLA-ABC


Hla polymerase chain reaction pcr

Τυποποίηση HLA με μοριακές τεχνικές (Polymerase chain reaction-PCR)

  • Tεχνική κατά την οποία ένα γονίδιο ή τμήμα του DNA πολλαπλασιάζεται σε εκατομμύρια αντίγραφα.

  • PCR-SSP

    (SSP=Sequence Specific Primers)

  • PCR-SSOP

    (SSOP=Sequence Specific Oligonucleotides Probes )

  • PCR-SBT

    (Sequencing Based Typing)


Pcr polymerase chain reaction

PCR (polymerase Chain Reaction)

  • In vitroενζυματική αντίδραση

  • Ανήκει στις μεθόδους ανίχνευσης του DNAμέσω πολλαπλασιασμού του στόχου

  • Τελικός σκοπός της αντίδρασης είναι ο εκθετικός πολλαπλασιασμός ενός τμήματος DNA που αποτελεί το στόχο της αντίδρασης

  • Εκμεταλλεύεται την in vivo δράση του ενζύμου DNAπολυμεράσηπου διαβάζει το μονόκλωνο DNA και έχοντάς το ως πρότυπο συνθέτει συμπληρωματική άλυσο DNA παρουσία τριφωσφορικώνδεοξυριβονουκλεοτιδίων.


Pcr ssp specific sequence primers

PCR-SSP (Specific Sequence Primers)

  • Tα πολλαπλασιασμένα τμήματα του DNA, διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης

  • Tο προϊόν της ηλεκτροφόρησης γίνεται ορατό ύστερα από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία με την προσθήκη χρωστικής EthidiumBromideκαι αποτυπώνεται σε φωτογραφικό χαρτί.

  • Με βάση ειδικούς πίνακες ανάγνωσης ή προγράμματαΗ/Υ (software) εξάγεται το τελικό αποτέλεσμα

    Εφαρμογές

    • τυποποίηση HLA τάξης Ι και ΙΙ

      γονιδίων

    • προσδιορισμός αλληλομόρφων

      διαφόρων γονιδίων


2068811

Υβριδισμός-αρχή μεθόδου

  • Μονές άλυσοι DNA με συμπληρωματική αλληλουχία νουκλεοτιδίων έχουν την τάση να συνδέονται (υβριδίζονται) και να σχηματίζουν δίκλωνο DNA.

  • Στο φαινόμενο αυτό στηρίζεται η ανίχνευση τμημάτων DNA γνωστής αλληλουχίας.

  • Ο υβριδισμός συνήθως συνδυάζεται με PCRγια την ανίχνευση γνωστών γονιδίων.


Pcr ssop sequence specific olygonucleotide probes

PCR-SSOP (Sequence Specific Olygonucleotide Probes)

  • Πολλαπλασιασμός συγκεκριμένων τμημάτων των γονιδίων που θέλουμε να μελετήσουμε με PCR

  • Ανίχνευση του προϊόντος με υβριδισμό με ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές σημασμένους(oligonucleotideprobes)


Pcr sbt sequencing based typing

PCR-SBT(Sequencing Based Typing)

  • Χρησιμοποιούνται:

  • Εκκινητής (primer), μονή άλυσος ολιγονουκλεοτιδίων συμπληρωματική του αρχικού τμήματος

  • Μίγμα νουκλεοτιδίωνdeoxynucleotide

  • Λίγα dideoxynucleotide

  • Τα dideoxy- μπορούν να συνδεθούν αλλά διακόπτουν την επιμήκυνση της αλύσου


Pcr sbt sequencing based typing1

PCR-SBT(Sequencing Based Typing)

  • Πραγματοποιούνται παράλληλα τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις αντιγραφής της αλληλουχίας

  • Κάθε μια περιέχει ένα διαφορετικό ddNTP(αλλά όλα τα dΝΤP), καθένα εκ των οποίων είναι σημασμένο

  • Προκύπτει ένα μίγμα από σημασμένες αλυσίδες διαφόρων μεγεθών, που τελειώνουν με ένα ddNTP στο 3΄άκρο


Pcr sbt sequencing based typing2

PCR-SBT(Sequencing Based Typing)

  • Γίνεται ηλεκτροφόρηση και λήψη αποτυπώματος σε φίλμ

  • Ειδικά software, δίδουν σε σύντομο χρονικό διάστημα το αποτέλεσμα

  • Σήμερα χρησιμοποιούνται συστήματα αυτόματης ανάλυσης της άγνωστης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας


Flow cytometry

Κυτταρομετρία ροής(flow cytometry)

  • Στόχος

  • Ανίχνευση

  • Μέτρηση

  • Αναγνώριση

  • Ταυτοποίηση

  • Διαλογή κυττάρων

    και άλλων σωματιδίων


Flow cytometry1

Κυτταρομετρία ροής(flow cytometry)

  • Διαγραμματική απεικόνιση κυτταρομετρίας ροής


2068811

Κυτταρομετρία ροήςΕφαρμογές

  • Τυποποίηση HLA.

  • Η οξεία φάση των αυτοάνοσων νοσημάτων χαρακτηρίζεται κατά κανόνα αποαύξηση της αναλογίας των CD4+ / CD8+Τ-λεμφοκυττάρων.

  • Η διαταραχή των Τ-λεμφοκυττάρων παρέρχεται μετά τη χορήγηση κατάλληλης ανοσοκατασταλτικής θεραπείας.

  • Η μείωση των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων σχετίζεται με την κλινική βαρύτητα της νόσου.

  • Ο CD19+ και ο CD5+υποπληθυσμός των Β-λεμφοκυττάρων θεωρείται υπεύθυνος για την παραγωγή των αυτοαντισωμάτων.


2068811

Κυτταρομετρία ροήςΕφαρμογές

  • Ποσοτικήκυτταρομετρία

  • Προσδιορισμός συγκέντρωσης διαλυτών ουσιών

  • Απομόνωση και παραλαβή καθαρών κυτταρικών πληθυσμώνκ.α.


2068811

Νέες μέθοδοι ανίχνευσης Aabs

  • Proteomics technologies

  • Καταγραφή ενός στιγμιότυπου του κυττάρου σε δεδομένη χρονική στιγμή.

  • Έλεγχος της έκφρασης,λειτουργίαςκαιαλληλεπίδρασηςπρωτεϊνών και γονιδίων στους πάσχοντες ιστούς, στους οποίους άλλα γονίδια ενεργοποιούνταικαιάλλααδρανοποιούνταισεσχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς.


2068811

Νομίζουμε ότι τα ´χουμε δει όλα ???

Οι εργαστηριακές τεχνικές εξελίσσονται……..


2068811

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

  • Μ. Μπούρα και συν.: Κλινική Ανοσολογία,2011.

  • Α. Γερμενής: Ιατρική Ανοσολογία.

  • BIORAD: Image Atlas.

  • Ε. Δίζα-Ματαυτσή: Αυτοαντισώματα και Νοσήματα του συνδετικού ιστού, 1997.

  • Σ.Δ.Ι. Δρυγιαννάκης, Χρ. Ι. Καλλούδη-Αντωνοπούλου: Τα αυτοαντισώματα στην καθ’ημέρα κλινική πράξη, 1992.

  • Γ. Κυριαζής: Ανοσοδιάγνωση. Γενικές αρχές. Σεμινάριο Ανοσολογίας, Ελληνική Εταιρεία Ανοσολογίας, 1997.

  • Αbul K. Abbas, Andrew H. Lichtman: Βασική ανοσολογία, 2004

  • Μικροβιολογικά χρονικά, 2009.

  • Μ. Παυλάτου: Ανοσολογία, 1997.


2068811

1. Ποιο από τα παρακάτω δεν ισχύει για τη μη ανταγωνιστική ELISA;

α) Η ένταση του αποτελέσματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας

β) Αποτελεί μέθοδο εκλογής για τον προσδιορισμό αυτοαντισωμάτων

γ) Το αποτέλεσμα επηρεάζεται από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (λιπαιμικός ή αιμολυμένος ορός)

2. Ποια από τα παρακάτω ισχύουν στη μέθοδο ανοσοαποτύπωσηςWestern blot;

α) Γίνεται ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των πρωτεϊνών με SDS-PAGEηλεκτροφόρηση

β) Η ανίχνευση του αντισώματος μπορεί να γίνει ανοσοενζυμικά

γ) Βρίσκει εφαρμογή στην ανίχνευση των SSA/Ro αντισωμάτων

δ)Το α και το γ

ε) Όλα τα παραπάνω

3. Για την κυτταρομετρία ροής δεν ισχύει:

α) Βρίσκει εφαρμογή στην τυποποίηση των HLA

β) Συνδυάζει τις αρχές σκέδασης και φθορισμού

γ) Στηρίζεται μόνο στην αρχή της σκέδασης

δ) Χρησιμεύει στη μελέτη της πορείας των αυτοάνοσων νοσημάτων


2068811

4) Τι από τα παρακάτω δεν ισχύει:

α) Φθορίζον αντίσωμα στον ανοσοφθορισμό είναι αντιορός έναντι της ανθρωπείου γ-σφαιρίνης σημασμένης με φθοριόχρωμα

β) Φθορισμός είναι η εκπομπή φωτός μικρότερου μήκους κύματος από μία ουσία όταν αυτή ακτινοβοληθεί με φως μεγαλύτερου μήκους κύματος

γ) Το φθοριόχρωμα που συνήθως χρησιμοποιείται στον ανοσοφθορισμό είναι η ισοκυανικήφλουορεσκίνη (FITC)

5) Η παρακάτω εικόνα του ανοσοφθορισμού σχετίζεται με :

α) ΑΜΑ

β) dsDNA

γ) ASMA

δ) Κανένα από τα παραπάνω


2068811

6) Η παρακάτω εικόνα ανοσοφθορισμού σχετίζεται με :

α) APCA

β) ΑΜΑ

γ) Κεντρομεριδίου

δ) Τα α και β

ε) Τα β και γ

7) Η παρακάτω εικόνα ανοσοφθορισμού σχετίζεται με :

α) Φθορισμό κεντρομεριδίου

β) Σύνδρομο CREST

γ) Φθορισμό πυρηνιδίου

δ) Τα α και β

ε) Τα β και γ


  • Login