Microinquinanti organici negli alimenti: diossine, PCB ed IPA.

1. Microinquinanti organici negli alimenti:diossine, PCB ed IPA. Francesco Paolo Serpe Napoli, 31 gennaio 2014

2. - Contaminanti degli alimenti - • La salubrità degli alimenti (prodotti carnei, prodotti ittici, latte e derivati, verdure, ortaggi, frutta, farmaci…) è minacciata da una serie di sostanze xenobiotiche che si possono ritrovare in essi. Queste sostanze possono essere distinte in tre categorie: 1) Additivi alimentari (es. conservanti, coloranti) 2) Farmaci veterinari (es. anabolizzanti utilizzati per scopi fraudolenti) 3) Inquinanti ambientali: • Chimici(POPs, idrocarburi, metalli pesanti, biotossine algali, tensioattivi…) • Microbiologici(virus, batteri, microalghe)

3. POPs (Persistent Organic Pollutants) • Hexachlorobenzene • Mirex • Toxaphene • Polychlorinated biphenyls (PCB) • Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD) • Polychlorinated dibenzofurans (PCDF) • Aldrin • Chlordane • DDT • Dieldrin • Endrin • Heptachlor Definiti dalla Convenzione di Stoccolma sugli Inquinanti Organici Persistenti (maggio 2001, entrata in vigore nel 2004) Sono sostanze organiche ubiquitarie generalmente clorurate aventi particolari caratteristiche chimico-fisiche tali che, una volta rilasciate nell’ambiente, esse restano intatte per periodi di tempo eccezionalmente lunghi. Sono poco volatili, idrofobiche (liposolubli, motivo per cui sono resistenti alla degradazione e si bioaccumulano nei tessuti adiposi) e tossiche. Nel maggio 2009 la Convenzione ha introdotto altri 9 POPs.

4. POPs (Persistent Organic Pollutants) Per alcuni di essi non sono del tutto chiari gli effetti nocivi sugli uomini, tuttavia è sempre maggiore l’evidenza che un’esposizione prolungata di piccole dosi di queste sostanze possa avere conseguenze rilevanti sulla salute umana, a causa del processo di bioaccumulo nei tessuti adiposi degli organismi superiori. I PCDD/PCDF si distinguono dagli altri POPs per il fatto di essere dei sottoprodotti di processi industriali o di incenerimento e non sono prodotti intenzionalmente. _____________________________ • L’interesse crescente per queste molecole è conseguenza di numerosi disastri ambientali… • I primi casi noti di contaminazione da diossine negli alimenti risalgono agli anni ’70, precisamente in Giappone (1968) ed a Taiwan (1979), Yusho e Yu-Cheng rispettivamente ; • Gravi episodi di danni all’uomo a seguito di attività industriali, si sono verificati negli Stati Uniti (Times Beach, 1971) ed in Italia (Seveso, 1976; ILVA) …ed alimentari • Nel 1999,la rivelazione di elevate concentrazioni di diossine in alimenti (carni di suini e pollame) in Belgio ha indotto l’Unione Europea a prendere iniziative a riguardo (cont.). • Etc..

5. Lipofilicità Una misura della lipofilicità delle molecole è data dal coefficiente di ripartizione acqua/n-ottanolo (Kow), che esprime la capacità di accumulo dei composti in “fasi” apolari, quali ad esempio i tessuti lipidici degli organismi Kow = [S]ottanolo/[S]acqua [S] = concentrazione della sostanza S espressa in molarità o ppm Piu spesso si usa il logKow L’EPA afferma che i composti per i quali logKow è maggiore di 3.5 devono essere considerati potenzialmente pericolosi.

6. LE DIOSSINE

7. Le diossine • Il termine diossina è oggi comunemente utilizzato per indicare un gruppo di sostanze costituito da 75 congeneri di policlorodibenzo-p-diossine (PCDD) e 135 congeneri di policlorodibenzofurani (PCDF) • PCDD/PCDF sono composti planari, triciclici, antiaromatici (da non confondere con non-aromatici), contenenti fino ad 8 atomi di cloro • PCDD/PCDF sono composti lipofili con un’alta temperatura di fusione (>593°K), una bassa tensione di vapore (<10-6 Pa) e sono particolarmente stabili • Il cloro aumenta la stabilità di questi composti ostacolandone la degradazione enzimatica (in particolare in posizione 2,3,7,8 come nella TCDD) ed incrementandone la tossicità poiché favorisce il legame all’Aryl Hydrocarbon Receptor (Ah).

8. Le diossine

9. Le diossine Tempi di emivita di alcune PCDD/F

10. Le diossine PCDD 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-diossina …chiamata anche: • Diossina • Diossina di Seveso • TCDD • 2,3,7,8-TCDD

11. Le diossine – isomeri o congeneri?

12. I POLICLORO BIFENILI

13. DL-PCB NDL-PCB PCB indicatori

14. La principale differenza strutturale fra i PCB e le diossine è la libertà rotazionale attorno al legame C-C 1-1’. La rotazione permette ai due anelli fenilici del PCB di giacere nello stesso piano (di assumere cioè una conformazione planare) come per le diossine oppure di giacere su due piani differenti. POPs diossina-simili: i PCB I PCB diossina-simili (dioxin-like PCBs; dl-PCBs) sono 12 dei 209 possibili congeneri di PCB che mostrano effetti tossici simili a quelli causati dalle diossine. Nel bifenile non sostituito da atomi di cloro, la rotazione è libera e la molecola può assumere qualsiasi conformazione, inclusa quella planare. Ma cosa accade se sono presenti dei sostituenti?

15. POPs diossina-simili:i PCB PCB non orto: può essere planare Andando a considerare i raggi atomici di Van der Waals si nota che, nei PCB orto, la rotazione C-C è completamente impedita. PCB orto: non può essere planare 2 2 6 6

16. POPs diossina-simili:i PCB La tossicità delle diossine sembra essere legata principalmente alla conformazione planare. Secondo un meccanismo proposto, la planarità e la idrofobicità permetterebbero loro di legare il recettore Ah e/o di mimare le basi azotate, intercalandosi nel DNA ed inducendo distorsioni nella doppia elica (continua…) Domanda: cosa distingue un PCB diossina simile da un PCB non diossina-simile? Risposta: la possibilità o meno di assumere una conformazione planare. I PCB in cui le posizione 2 e 6 (2’ e 6’) sono occupate da atomi di cloro (I PCB orto) non possono assumere la conformazione planare e non possono comportarsi come le diossine. I PCB le cui posizioni orto sono libere sono 12 e sono detti PCB diossina-simili

17. Sommario Policlorodibenzo-p-diossine 75 congeneri Policlorodibenzofurani 135 congeneri Policlorobifenili 209 congeneri totali 12 congeneri diossina-simili Totale: 222 molecole

18. I PCB indicatori La ricerca dei PCB di maggiore interesse tossicologico (come i DL-PCB) parte molto spesso dalla ricerca dei PCB che maggiormente si ritrovano nell’ambiente e negli alimenti, i PCB indicatori (non necessariamente tossici, in genere confusi con i NDL-PCB). Dedalo normativo: • PNR 2000: sette PCB indicatori (sei NDL ed uno DL) • PNR 2004: diciotto PCB (comprendendo due DL-PCB) • Monitoraggio EFSA 2010: sei NDL-PCB (28, 52, 101, 138, 153 e 180; ovvero i sette del 2000 meno il DL-PCB)

19. Monitoraggio di 6 NDL-PCB indicatori in alimenti e mangimi di 18 Paesi UE, Norvegia ed Islanda tra il 1995-2008. Nel report sono contenuti i risultati delle determinazioni effettuate su più di 12000 campioni. Gli alimenti più contaminanti sono risultati i prodotti della pesca, seguiti da latte e derivati. Il monitoraggio dell’EFSA si va a collocare in un periodo di transizione (1995-2008), sia perché gli anni ’90 sono stati i primi anni PCB-free (con una eterogenea distribuzione dei PCB), sia perchè la normativa e le misure attuative da parte della Comunità Europea in quegli anni sono state in continuo divenire.

20. SORGENTI DI DIOSSINE

22. Sorgenti di PCDD/F • Le diossine non erano presenti nell’ambiente prima dell’industrializzazione se non in piccole quantità dovute alla naturale combustione ed a processi geologici. • PCDD/PCDF derivano da processi quali: • Incenerimento (combustione) di rifiuti e di materiali contenenti cloro (ad es. plastiche) • Vengono rilasciate nell’aria per poi ricadere al suolo. • Oppure da attività industriali quali: • Attività di fonderie • Produzione di pesticidi, erbicidi, fungicidi, conservanti, olii ed inchiostri • Sbiancamento della carta • Produzione di idrogeno • Oltre a ricadere sui suoli, esse si ritrovano anche in sedimenti ed acque. • Sono contaminanti di alimenti quali carni, pesci, verdure, latte e derivati.

23. Sorgenti di PCDD/F 2.3% 2% 6.8 % 6.9 % 30 % 15 % 20 % 17 % L’incenerimento di rifiuti municipali ed ospedalieri, insieme ad altri processi di combustione (incendi incontrollati) rappresentano le fonti principali di immissione di diossine nell’ambiente.

24. Sorgenti di PCDD/F - combustione • Combustione ed incenerimento di rifiuti urbani (inc. vecchia generazione). I meccanismi mediante i quali si formano le PCDD/F non sono stati ancora ben compresi. • Tra le ipotesi più accreditate si annoverano: • I PCDD/F sono già presenti nel materiale da incenerire • Vengono prodotti a partire da precursori clorurati come PCB, fenoli o benzeni clorurati • Si formano attraverso una sintesi de novo dalla pirolisi di composti chimici come i PVC, polistirene, cellulosa, lignina in presenza di sostanze donatrici di cloro (come gli stessi residui di PVC o il cloro inorganico) Probabilmente queste ipotesi sono tutte vere. DI certo, i PCDD/F si formano quando C, O e Cl sono in presenza di un catalizzatore metallico a temperature comprese fra 300 e 700°C

25. - Un inceneritore di Vienna - Brescia - Inceneritore low cost Sorgenti di PCDD/F: incenerimento rifiuti

26. Sorgenti di PCDD/F - attività industriali Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD), dibenzofurans (PCDF) and polychlorinated biphenyls (PCB): main sources, environmental behaviour and risk to man and biota. Review. Márcia de Souza Pereira. Quím. Nova vol.27 no. 6 (2004).

27. Sorgenti di PCDD/F (attiv. industriali - Seveso) L´attività dell’ICMESA di Seveso si fondava sulla fabbricazione e sul commercio di prodotti aromatici sintetici, di prodotti intermedi (per l´industria farmaceutica e per quella dei coloranti organici) e di prodotti di base per l´industria chimica tra cui il triclorofenolo, prodotto chimico intermedio utilizzato principalmente nella formulazione dei diserbanti. Esplosione del reattore - 10 luglio 1976 Il reattore per la produzione di TCP grezzo si trovava in fase di raffreddamento. Conteneva tetraclorobenzolo, etilenglicole e soda caustica. Durante l’esplosione fuoriuscirono circa 400 kg di reattivi e prodotti di reazione. La nube tossica comprendeva tra l´altro triclorofenolo, soda caustica e 3,5% di TCDD (pari quindi a 14 kg) e si diffuse in un’area di 15 km2 abitata da 37000 persone.

28. SORGENTI DI PCB

29. - PCB: fonti e tossicità - I PCB sono stati prodotti per molti anni (tra 1930 e 1980 circa) per la bassa infiammabilità e le proprietà elettriche. Usati per scopi industriali, ad esempio come ritardanti di fiamma nei circuiti stampati, applicazioni ferroviarie, fotocopiatrici, come fluidi dielettrici, etc.. L’esposizione prolungata a queste sostanze può avere conseguenze rilevanti sulla salute a causa del processo di bioaccumulo. I PCB sono prodotti intenzionalmente (come tutti i POPs ad eccezione dei PCDD/F). Oggi ne è vietata la produzione in molti paesi. In altri paesi invece sono ancora prodotti (Russia) nonostante siano stati inclusi fra i POPs. Oggi esistono dei piani di corretto smaltimento dei PCB.

31. INGRESSO NELLA CATENA ALIMETARE

33. Ingresso nella catena alimentare • Nel Regolamento CE 2375/2001 fu evidenziato per la prima volta che il 90 % dell’esposizione umana cronica alla diossina è dovuta all’alimentazione, di cui circa l’80% deriva dal consumo di alimenti di origine animale provenienti da organismi terrestri ed acquatici che abbiano bio-accumulato questi composti. • Gli alimenti maggiormente a rischio risultano essere: • Pesce • Carne • Latte • Prodotti lattiero-caseari • Carne, latte e prodotti lattiero-caseari. La causa principale di ingresso nella catena alimentare è la deposizione atmosferica. Animali come i ruminanti possono accumulare diossine nei loro tessuti adiposi in seguito all’ingestione di erba contaminata oppure di mangimi esposti all’aria, oppure in seguito all’ingestione accidentale di terreno contaminato durante il pascolo (Schulz et al., 2005; Fürst et al., 1993). • Nei ruminanti, durante la lattazione, avviene infine il fenomeno della deplezione delle sostanze liposolubili (incluse le diossine) dai tessuti adiposi dell’animale al latte.

34. Ingresso nella catena alimentare Pesce. Risente particolarmente della contaminazione da diossine, in quanto perfettamente in grado di bio-accumulare e bio-magnificare tali sostanze. Ci sono innumerevoli casi in letteratura che riportano della presenza di diossine in prodotti ittici. I risultati di un recente studio (2007) condotto da un gruppo di ricercatori di Marghera sul sangue dei veneziani mostrano che i consumatori di pesce e molluschi di laguna risultano contaminati in modo maggiore rispetto ai lavoratori della chimica. La via principale di contaminazione è sempre la deposizione atmosferica anche se, nel caso dei prodotti ittici, c’è da considerare anche il contributo delle acque reflue degli impianti (a ridosso del mare). Il profilo dei congeneri è indicativo della sorgente di diossine e permette molto spesso di identificarla (Alcock et al., 2002).

35. Figure 2 -PCDD/F congener distribution in the compliant (WHO-TEQ PCDD/F < 3) and non-compliant (WHO-TEQ PCDD/F > 3) sheep milk samples. (…) the congeners distribution in the ovine non-compliant samples overlaps the congeners distribution in milk samples collected in farms located near known dioxin sources, such as incinerators (Ramos et al., 1997). (da Esposito et al., 2010)

36. FATTORI DI TOSSICITA’

37. Fattore di Tossicità Equivalente Due assunzioni: 1) Si parte dal presupposto che la TCDD sia l’unica diossina completamente caratterizzata dal punto di vista tossicologico. 2) Si assume che altri congeneri PCDD/F ed i non-orto/mono-orto PCB siano in grado di provocare gli stessi effetti della TCDD ma con un’intensità diversa. Allo scopo di stimare il potere tossico delle altre diossine, stati introdotti i Fattori di Tossicità Equivalente (TEF, Van der Berg et al., 1998) calcolati in seguito a studi di tossicità effettuati in vivo ed in vitro su diossine e non-orto PCB. Note: • Esistono diversi TEF (International-TEF, Nordic-TEF, etc..) ma quelli che trovano più consenso sono i WHO-TEF. • Il WHO-TEF non è altro che un fattore correttivo da applicare alla concentrazione analitica del congenere. Il risultato ottenuto rappresenta il TEQ ossia la Tossicità Equivalente. • La tossicità totale di una miscela di diossine e PCB (ovvero la somma delle concentrazioni corrette per i TEFs) è data dalla somma dei TEQs

38. TEFs per l’uomo ed i mammiferi

39. EFFETTI SULLA SALUTE

40. Effetti sulla salute: PCDD/F e dl-PCB È stato dimostrato che l’esposizione prolungata (cronica) a diossine causa danni al fegato, alterazioni del sistema immunitario, formazione e promozione di tumori, teratogenesi, malattie della pelle, alterazione dei livelli ormonali e dei fattori di crescita.(Ahlborg et al., 1988; Peterson et al., 1993; Phjanvirta et al., 1994; Poland et al., 1982; Bertazzi et al., 1998) In quasi tutti i casi si fa riferimento alla TCDD. La difficoltà degli studi di tossicità sull’uomo è legata al fatto che tali studi possono essere condotti solo in casi di incidenti sporadici e spesso la comunità scientifica ha espresso pareri discordanti. Gli effetti da esposizione acuta, osservati in occasione di alcuni incidenti, danno luogo a meno incertezze in quanto si è trattato principalmente di malattie cutanee come cloracne, congiuntiviti, cisti sebacee ed iperpigmentazioni.

41. Effetti sulla salute: PCDD/F e dl-PCB Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD), dibenzofurans (PCDF) and polychlorinated biphenyls (PCB): main sources, environmental behaviour and risk to man and biota. Review. Márcia de Souza Pereira. Quím. Nova vol.27 no. 6 (2004).

42. Effetti sulla salute:Possibili meccanismi biochimici Interazione tra le diossine ed il recettore Ah (Hankinson 1995; Okey et al., 1994; Poellinger 1995) Il legame tra il PCDD/F ed una proteina citoplasmatica, il recettore Ah (aryl hydrocarbon), rappresenta il primo stadio del meccanismo biochimco, ancora non completamente descritto, che spiega gli effetti tossici delle diossine. Tale legame ha effetti importanti sulla regolazione dell’espressione genica ed è costituito dalle seguenti fasi: • Legame fra diossina e recettore Ah; • Traslocazione nel nucleo celulare e formazione di un eterodimero con la proteina Arnt (Ah receptor nuclear translocator protein); • Legame fra l’eterodimero ed il DNA; • Attivazione dell’attività trascrizionale per alcuni geni (meccanismo simile ad alcuni ormoni steroidei)

43. Effetti sulla salute:Possibili meccanismi biochimici

44. Effetti sulla salute:Possibili meccanismi biochimici • Possibili conseguenze del legame con il recettore Ah • Un gene che sicuramente viene trascritto in seguito a tale meccanismo è quello codificante per l’enzima citocromo P4501A1. Ciò è stata dimostrata essere la causa di numerose alterazioni metaboliche. • Un altro effetto del legame con il recettore Ah ampiamente documentato è l’azione anti-estrogenica dovuta all’induzione del metabolismo degli estrogeni. Per questo motivo le diossine sono state etichettate anche come endocrine disruptors. • Infine tale legame è probabile che sia coinvolto nei meccanismi carcinogenici causati dalle diossine. Ad esempio il meccanismo secondo il quale le diossine si comportino come agenti intercalanti del DNA(v. bromuro di etidio).

45. Effetti sulla salute 1997 La WHO (OMS) International Agency for Research on Cancer (IARC) ha stabilito che la TCDD è cancerogena per l’uomo in quanto è stata dimostrata essere un de-regolatore della normale crescita cellulare. Le altre motivazioni ed i relativi meccanismi molecolari proposti per dimostrare la cancerogenicità della TCDD sono ipotetici 1998 il WHO European Center for Environment and Health (WHO-ECEH) e l’International Programme on Chemical Safety (ICPS) hanno stabilito i rischi per la salute umana dovuti all’esposizione da diossine e la relativa Quantità Giornaliera Tollerabile ossia la Tolerable Daily Intake Dose (TDI). Nell’occasione, gli Stati Membri furono invitati a ridurre al minimo l’immissione di diossine nell’ambiente.

46. Effetti sulla salute Sulla scia della letteratura scientifica, la stima della quantità di diossine assimilabile per giorno è variata negli anni. Tolerable daily intake (TDI; dose giornaliera tollerabile) Definizione: quantità massima di una certa sostanza che può essere assunta in modo prolungato nel tempo senza causare danni alla salute La maggior parte dei TDI sono stati stabiliti in seguito a studi effettuati su animali, a cui e applicato un fattore correttivo (di 100 in genere) per ricavare i TDI nell’uomo. 1998 La WHO ha suggerito come TDI per le diossine un valore di 1-4 pg TEQ/kg di peso corporeo al giorno. 2001 Il Comitato Scientifico dell’Alimentazione Umana (SCF) ha stabilito una dose settimanale ammisibile di 14 pg e mensile di 70 pg TEQ/kg di peso corporeo.

47. POPs emergenti

48. Assenza limite di legge negli alimenti • Polibromodifenileteri – PBDE • Perfluorottano sulfonato – PFOS • Acido perfluoroottanoico – PFOA

49. Normativa

50. Premessa • È del 2002 la Raccomandazione CE 201/2002 in cui la CE ha prescritto per la prima volta le azioni da intraprendere per ridurre la presenza di diossine e PCB diossina-simili in alimenti e mangimi, prevedendo in seguito un piano di monitoraggio da parte degli Stati Membri comprendente, ove possibile, anche i PCB non diossina-simili.